CIRP抑制低剂量UVB诱导的角质细胞生长阻滞及凋亡作用的分子机制研究

发布时间：2017-08-29 05:25

  本文关键词：CIRP抑制低剂量UVB诱导的角质细胞生长阻滞及凋亡作用的分子机制研究

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【摘要】：越来越多的证据表明紫外线(UV)造成的皮肤损伤增加了皮肤癌发生的风险。皮肤癌包括基底细胞癌、鳞状细胞癌以及皮肤恶性黑色素瘤,其中基底细胞癌和鳞状细胞癌一类的非黑色素瘤皮肤癌占了皮肤癌发病的大多数。UVB过度暴露会造成细胞DNA损伤并诱导激活细胞内多种信号通路,例如细胞生长抑制以及细胞凋亡。这些信号通路的激活在决定UVB照射后细胞命运的过程中扮演重要角色。但是UVB,特别是长期低剂量UVB照射诱导皮肤癌发生的分子机制尚在研究之中。冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)在UV诱导仓鼠细胞DNA损伤的过程中首次被发现。它属于冷休克蛋白家族(CSPs)中的一员,并能够在响应冷刺激过程中起RNA分子伴侣的作用。正常细胞应激响应时,CSPs能够从细胞核转移至细胞质中,并辅助应激状态下细胞质中的翻译进程。研究报道CIRP能够保护细胞免受TNFα和具有遗传毒性的逆境诱导的细胞生长阻滞和细胞凋亡,同时还能通过p53信号通路抑制DNA损伤诱发的细胞凋亡。研究还报道CIRP与炎症反应以及多种肿瘤发生有密切的联系。另外,最新的研究证明肝脏细胞中CIRP的表达水平与信号转导和转录激活因子3(Stat3)的表达水平正相关,而Stat3调节多种细胞信号通路,包括细胞周期、细胞凋亡以及肿瘤血管生成等。研究普遍认为Stat3的磷酸化激活(p-Stat3)在紫外线过度暴露后皮肤癌发生过程中起十分关键的作用。UVB通过磷酸化Stat3蛋白705位点上的Tyr残基来激活Stat3。研究发现组成型激活Stat3多与人类肿瘤以及癌细胞密切相关。但是CIRP与p-Stat3对UVB照射后的角质细胞的调节功能还有待阐明。在本文中,我们主要研究了UVB照射处理后CIRP在调控细胞生长阻滞,细胞凋亡以及角质细胞转化中的作用,主要实验结论如下:(1)CIRP蛋白在所有测试的黑色素瘤以及非黑色素瘤皮肤癌细胞系中都表达上调;并且低剂量UVB(5 mJ/cm2)偶发或长期照射处理都能诱导角质细胞上调CIRP的表达水平,而高剂量UVB(50 mJ/cm2)偶发照射处理却降低了CIRP在细胞中的表达水平;同时我们观察到低剂量UVB诱导CIRP上调的同时伴随着其从细胞核向细胞质中转移。(2)UVB诱导的CIRP表达上调或是过表达CIRP都增强了角质细胞对UVB诱导细胞生长阻滞及细胞死亡的抗性;siRNA瞬时沉默或是shRNA稳定沉默CIRP基因都增强了角质细胞对低剂量UVB照射处理的敏感性。(3)我们的实验结果还证明CIRP的表达对低剂量UVB诱导Stat3的磷酸化激活是必须的,但是CIRP的表达变化不改变Stat3的表达总量;p-Stat3的表达与两个已知的Stat3下游基因cyclin D1和VEGF的表达水平有关。同样,凋亡调控因子Bag-1/S的表达也与p-Stat3的表达密切相关。(4)利用S3I-201抑制Stat3的磷酸化激活,致使p-Stat3与Bag-1/S的表达量降低,同时伴随着UVB照射后细胞存活和增值能力的下降;稳定过表达Bag-1/S能够部分削弱S3I-201对低剂量UVB照射后细胞存活和增殖能力的抑制作用。(5)我们的数据还表明虽然siRNA沉默CIRP或Bag-1基因对无UVB照射处理的角质细胞中裂解PARP/PRAP的比例以及Caspase-3的激活没有影响,但是却能明显增强UVB照射处理后细胞中裂解PARP/PRAP的比例以及活化的Caspase-3的表达量。此外,稳定过表达Bag-1/S能够完全抑制UVB诱导的PARP裂解以及Caspase 3的激活。根据以上结果我们提出CIRP-p(Tyr705)-Stat3信号通路,通过分别调控cyclin D1和Bag-1/S来调控UVB照射处理后细胞的增殖和存活。本实验研究加深了我们对CIRP在低剂量UVB致癌过程中的作用的理解,研究结果证实CIRP能够作为一个新的干预低剂量UVB诱导皮肤癌形成的靶点,可以为开发皮肤癌防御和治疗的药物方法提供研究基础,并具有临床指导意义。
【关键词】：CIRP Stat3 p-Stat3 Bag-1/S UVB照射 细胞存活 细胞生长
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-11
• 主要缩略词11-13
• 1 绪论13-27
• 1.1 提出问题和意义14-17
• 1.2 国内外研究现状17-24
• 1.2.1 Stat3在UVB诱导皮肤癌中的作用17-19
• 1.2.2 新一代原癌基因CIRP19-24
• 1.3 研究目的以及研究内容24-27
• 1.3.1 研究目的24
• 1.3.2 主要研究内容24-25
• 1.3.3 本研究的创新性25-27
• 2 CIRP在皮肤癌细胞以及UVB诱导的角质细胞中的表达27-47
• 2.1 前言27-28
• 2.2 实验仪器、材料与试剂28-30
• 2.2.1 实验仪器28
• 2.2.2 实验材料与试剂28-30
• 2.3 实验方法30-39
• 2.3.1 细胞复苏、培养及冻存30-31
• 2.3.2 Western blot31-33
• 2.3.3 总RNA提取以及反转录33
• 2.3.4 重组载体构建（pLNCX2-GFP, pLNCX2-GFP-CIRP）33-37
• 2.3.5 质粒瞬时转染37
• 2.3.6 构建稳定表达GFP以及GFP-CIRP融合蛋白的HaCaT细胞株37-38
• 2.3.7 UVB照射处理38
• 2.3.8 免疫荧光染色38-39
• 2.3.9 数据统计分析39
• 2.4 实验结果39-44
• 2.4.1 细胞培养39-40
• 2.4.2 CIRP在皮肤癌细胞以及低剂量UVB诱导的角质细胞中表达上调40
• 2.4.3 重组质粒pLNCX2-GFP和pLNCX2-GFP-CIRP的构建40-43
• 2.4.4 低剂量UVB照射处理后CIRP在角质细胞中的定位43-44
• 2.5 讨论44-45
• 2.6 本章小结45-47
• 3 低剂量UVB慢性暴露诱导角质细胞转化47-57
• 3.1 前言47
• 3.2 实验仪器、材料与试剂47-49
• 3.2.1 实验仪器47-48
• 3.2.2 实验材料与试剂48-49
• 3.3 实验方法49-52
• 3.3.1 UVB照射处理49-50
• 3.3.2 Western blot50-51
• 3.3.3 细胞活性检测51
• 3.3.4 克隆生成实验51
• 3.3.5 数据统计分析51-52
• 3.4 实验结果52-54
• 3.4.1 低剂量UVB慢性暴露诱导HaCaT细胞转化52-53
• 3.4.2 不同剂量UVB照射处理后HaCaT和HaCaTt细胞的生存能力53-54
• 3.5 讨论54-55
• 3.6 本章小结55-57
• 4 沉默CIRP基因对角质细胞响应UVB照射的影响57-75
• 4.1 前言57-58
• 4.2 实验仪器、材料与试剂58-61
• 4.2.1 实验仪器58-59
• 4.2.2 实验材料与试剂59-61
• 4.3 实验方法61-65
• 4.3.1 CIRP shRNA重组载体构建61-63
• 4.3.2 质粒瞬时转染63
• 4.3.3 构建稳定表达scrambled-shRNA以及CIRP-shRNA63-64
• 4.3.4 UVB照射处理64
• 4.3.5 Western blot64
• 4.3.6 RNA干扰实验64
• 4.3.7 细胞活性检测64-65
• 4.3.8 数据统计分析65
• 4.4 实验结果65-72
• 4.4.1 重组质粒pLKO.1-scrambled-shRNA和pLKO.1-CIRP-shRNA65-66
• 4.4.2 构建shRNA稳定沉默CIRP基因的HaCaT细胞株66-67
• 4.4.3 shRNA稳定沉默CIRP基因增强HaCaT细胞对UVB照射的敏感性67-69
• 4.4.4 siRNA瞬时沉默CIRP基因增强HaCaT细胞对UVB照射的敏感性69-72
• 4.5 讨论72-73
• 4.6 本章小结73-75
• 5 稳定过表达CIRP基因对角质细胞响应UVB照射的影响75-85
• 5.1 前言75
• 5.2 实验仪器、材料与试剂75-78
• 5.2.1 实验仪器75-76
• 5.2.2 实验材料与试剂76-78
• 5.3 实验方法78-80
• 5.3.1 CIRP过表达重组载体构建78-79
• 5.3.2 质粒瞬时转染79
• 5.3.3 构建稳定过表达CIRP的HaCaT细胞株79-80
• 5.3.4 UVB照射处理80
• 5.3.5 Western blot80
• 5.3.6 细胞活性检测80
• 5.3.7 数据统计分析80
• 5.4 实验结果80-84
• 5.4.1 重组质粒pLenti CMV CIRP的构建80-82
• 5.4.2 构建CIRP稳定过表达的HaCaT细胞株82-83
• 5.4.3 稳定过表达CIRP基因降低HaCaT细胞对UVB照射的敏感性83-84
• 5.5 讨论84
• 5.6 本章小结84-85
• 6 CIRP-p-Stat3调控低剂量UVB诱导的Bag-1/S表达变化85-99
• 6.1 前言85
• 6.2 实验仪器、材料与试剂85-88
• 6.2.1 实验仪器85-86
• 6.2.2 实验材料与试剂86-88
• 6.3 实验方法88-91
• 6.3.1 Bag-1/S过表达重组载体构建88-90
• 6.3.2 质粒瞬时转染90
• 6.3.3 构建稳定过表达Bag-1/S的HaCaT细胞株90
• 6.3.4 药物S3I-201处理以及药物低剂量UVB联合处理HaCaT细胞90
• 6.3.5 UVB照射处理90
• 6.3.6 S3I-201的细胞毒性检测90-91
• 6.3.7 Western blot91
• 6.3.8 细胞活性检测91
• 6.3.9 数据统计分析91
• 6.4 实验结果91-97
• 6.4.1 低剂量UVB诱导Bag-1/S表达上调需要激活Stat391-92
• 6.4.2 构建Bag-1/S稳定过表达的HaCaT细胞株92-94
• 6.4.3 CIRP-Stat3-Bag-1/S信号调控UVB照射后HaCaT细胞的存活和增殖94-97
• 6.5 讨论97-98
• 6.6 本章小结98-99
• 7 CIRP以及Bag-1/S调控UVB诱导的角质细胞凋亡99-107
• 7.1 前言99
• 7.2 实验仪器、材料与试剂99-101
• 7.2.1 实验仪器99-100
• 7.2.2 实验材料与试剂100-101
• 7.3 实验方法101-102
• 7.3.1 RNA干扰实验101-102
• 7.3.2 UVB照射处理102
• 7.3.3 Western blot102
• 7.4 实验结果102-104
• 7.4.1 CIRP和Bag-1/S调控UVB诱导的细胞凋亡102-103
• 7.4.2 Bag-1/S过表达抑制UVB诱导的细胞凋亡103-104
• 7.5 讨论104-105
• 7.6 本章小结105-107
• 8 结论与展望107-111
• 8.1 主要结论107-109
• 8.2 工作展望109-111
• 致谢111-113
• 参考文献113-131
• 附录 作者在攻读博士学位期间发表论文及专利情况131

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本文编号：751553