甲真菌病致病菌毒力因子的体外研究

发布时间：2017-09-20 20:33

  本文关键词：甲真菌病致病菌毒力因子的体外研究

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【摘要】：研究背景 甲真菌病是目前甲病中最常见的疾患，占甲病的50%以上。重要致病菌为皮肤癣菌、酵母菌和非皮肤癣菌类菌。甲真菌病的发病率近年一直在增加，诱发因素有如潮湿的环境、鞋袜不透气、反复的甲损伤、慢性疾病如糖尿病、外周血管障碍性疾病、HIV感染，还有其他的免疫抑制状态这些易感因素都可能诱发甲真菌病。甲真菌病的发病率随着年龄的增长而增加，近30%的患者为60岁的老年人。近年儿童的发病率也有报道。 甲真菌病的研究一直是皮肤真菌学研究的重点之一，现阶段甲真菌病的体外实验模型已成为了研究该病的一个可靠的实验模型，最适宜的研究对象无疑是人甲，但是由于需要符合的人甲很难获得，所以猪甲板和牛甲板是甲真菌病最为理想的动物模型。建立一个科学、经济、简单的体外甲真菌病模型对于探讨不同真菌引起甲感染的发病机理及评估药物治疗甲病疗效具有重要意义。 引起甲真菌病最主要的致病菌为皮肤癣菌，皮肤癣菌引起的感染遍布全世界，在全球被认为是一个重要的公共卫生问题。红色毛癣菌属于皮肤癣菌属的毛癣菌属，是分布最广泛的亲人性皮肤癣菌，占人类所有皮肤癣菌病的69.5%，亲人性的红色毛癣菌是临床上最重要的致病菌。红色毛癣菌最容易侵犯人和动物的皮肤角质层、甲，寄生或腐生于表皮角质、甲板和毛发的角蛋白组织中，引起各种癣病，且病程持久、难治愈、易复发。 红色毛癣菌的高发病率以及亲人特性使得它成为了研究浅部真菌的典范。近年来，虽然许多学者对红色毛癣菌的生物学特性进行了一定研究，但还是有许多问题仍需要解释，尤其是红色毛癣菌与角蛋白的关系，在角蛋白培养基上的生长特性，红色色素产生的影响因素。目前，还没有相关实验对红色毛癣菌这个生物学特性进行研究和报道。 红色毛癣菌最突出的生物学特点是嗜角蛋白性。角蛋白富含半胱氨酸，由于其含有很多的二硫键，所以结构特别稳定。红色毛癣菌在侵袭组织的过程中可以产生许多蛋白水解酶，分解皮肤中的角蛋白、胶原蛋白、弹力蛋白成短肽和氨基酸，为其生长代谢提供所需养分，同时也有利于菌体向周围组织扩散及深层组织侵入，因此，被认为是主要的毒力因子。角蛋白酶是这些蛋白水解酶中研究最为深入的、毒力最为重要的一种。迄今为止，国内外对真菌分泌角蛋白酶的研究较多，但主要集中在研究不同菌种分泌的角蛋白酶。但对于不利环境下的红色毛癣菌如何适应并致病？以及如何调节自身的角蛋白酶活力表达研 究却很少。本课题就甲真菌病的致病过程以及致病菌的毒力因子展开研究，包括以下三部分： 第一部分甲真菌病模型的体外实验研究 目的构建甲真菌病体外模型研究，以期观察不同致病真菌侵袭甲板的过程。 方法我们使用猪甲作为体外实验模型，在每枚甲板腹侧面中央黏粘了一个“O”型圈，将受试菌液加入“O”型圈内，放入培养箱30℃培养。每日观察真菌生长情况，并比较不同真菌穿透甲板的速率，同时用病理和电镜的方法来观察真菌侵袭甲板并在甲板中的生长情况。 结果我们成功的构建了甲真菌病实验模型，观察到皮肤癣菌以及白念珠菌侵袭角蛋白的大体形态学变化和微观结构改变。 结论该模型设计具有科学性和创新性，比较接近临床甲真菌病模型，该实验模型让我们更直观的观察到不同致病真菌侵袭甲板的过程。 第二部分不同蛋白对红色毛癣菌生物学特性影响研究 目的探讨不同营养成分对红色毛癣菌生长性状的影响 方法将红色毛癣菌以点接种方式分别接种于不同营养琼脂培养基上，如马铃薯葡萄糖培养基、沙氏培养基、胰蛋白葡萄糖、角蛋白葡萄糖、葡萄糖培养基以及不含葡萄糖培养基上，在30℃培养，动态观察菌落形态、颜色、产孢情况并测量菌落直径，绘制生长曲线图。 结果从菌落生长曲线形态大小来看，马铃薯葡萄糖和沙氏培养基蛋白质含量丰富，为红色毛癣菌生长提供了丰富的营养，故菌落生长直径最大；而角蛋白培养基相对来说由于角蛋白营养稍差，故菌落生长直径稍小；在没有蛋白仅有葡萄糖作为碳源的情况下皮肤癣菌生长不良，而仅有琼脂的情况下皮肤癣菌无法生长。 结论红色毛癣菌在含有蛋白的培养基上生长良好，不含蛋白生长不良。同时PH偏酸有助于产生红色色素。 第三部分甲真菌病致病菌角蛋白酶的动态测量 目的不同的底物对真菌角蛋白酶活性的影响以及红色毛癣菌在不良环境下的致病性。 方法1、用不同底物（角蛋白、葡萄糖、胰蛋白胨）分别诱导不同真菌，应用keratin--azure结合分光光度法培养上清液中的角蛋白酶活性。2、分别以不同蛋白为底物，红色毛癣菌在H2O2、特比奈芬和伊曲康唑的作用刺激下，测量角蛋白酶活性。 结果不同底物诱导真菌产生角蛋白酶活性由高到低依次为角蛋白、胰蛋白、葡萄糖。皮肤癣菌产生角蛋白酶活性高于酵母菌。在一定损伤作用下，当以角蛋白为底物时红色毛癣菌角蛋白酶反而升高。 结论不同底物诱导真菌角蛋白酶的活性不同。在角蛋白为底物时，红色毛癣菌在遇到一定程度的损伤时可以通过调节自身角蛋白酶的表达，抵御氧化剂的损伤。
【关键词】：皮肤癣菌病 红色毛癣菌 甲真菌病模型 生长曲线 角蛋白酶
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R756
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-11
• 中英文缩略词对照表11-12
• 前言12-17
• 第一部分 甲真菌病体外模型研究17-32
• 引言17-18
• 材料与方法18-23
• 结果23-28
• 讨论28-32
• 第二部分 不同蛋白对红色毛癣菌生物学特性影响研究32-47
• 引言32
• 材料与方法32-39
• 结果39-44
• 讨论44-47
• 第三部分 甲真菌病致病菌角蛋白酶的动态表达47-65
• 引言47-48
• 材料与方法48-55
• 结果55-61
• 讨论61-65
• 参考文献65-70
• 综述70-80
• References77-80
• 在读期间发表论文情况说明80-81
• 致谢81

【参考文献】

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本文编号：890236