热处理在UVB诱导的人黑素细胞损伤中的作用及其分子机制研究

发布时间：2017-09-26 03:24

  本文关键词：热处理在UVB诱导的人黑素细胞损伤中的作用及其分子机制研究

  更多相关文章： 热处理 UVB 黑素细胞 氧化应激 Hsp70

【摘要】：白癜风是一种获得性、多因性、脱色性疾病,主要特征为表皮功能性黑素细胞(MC)进行性消失导致的白色皮损。应用波长在290-320 nm的紫外线(UVB)进行光疗,是目前白癜风最为广泛和有效的治疗手段。表皮的角质形成细胞(KC)和MC可吸收UVB,并诱发多种生物效应,最终促使皮损复色。除了治疗作用,UVB的副作用也不容忽视,高剂量的UVB辐射可以诱导氧化应激、DNA变异等损伤作用,最终导致皮肤老化和皮肤肿瘤。在白癜风患者中,广泛存在抗氧化系统缺陷,高剂量的UVB可以加速MC的氧化应激反应,降低治疗效果。研究发现,热处理(42℃,1h)可刺激MC增殖,增强黑色素合成,对白癜风具有治疗作用。热处理还可以通过上调热休克蛋白(HSP),增加细胞对多种刺激的耐受力,进而提示,热处理可能在促进色素恢复的同时,降低UVB诱导的各种细胞损伤。目的:观察热处理在UVB诱导的MC损伤中的作用,研究热处理对诱导型Hsp70分布和表达的影响,初步探索Hsp70保护MC对抗UVB损伤的分子机制。方法:从人包皮获得原代MC,在3-4次传代后MC纯化。将细胞分为四组:对照组(37℃正常培养)、热处理组(42℃,1h)、UVB组(100mJ/cm2 UVB辐射)、联合组(热处理后照射100mJ/cm2 UVB),所有组连续干预3d。应用MTT法检测细胞活率,应用流式细胞仪(fcm)检测细胞凋亡率,应用生物化学方法检测总超氧化物歧化酶(sod)活力和丙二醛(mda)水平,应用荧光显微镜观察细胞内活性氧(ros)水平,并通过fcm测量细胞内ros,应用real-timepcr检测mnsodmrna表达水平。为了进一步探索热处理后hsp70水平与uvb损伤之间的关系,分别在热处理后0h,2h,4h,6h,8h,10,12h给予500mj/cm2uvb辐射,应用westernblot检测不同时间点hsp70表达水平,同时应用彗星实验检测该时间dna的损伤情况。应用hsp70特异性的sirna转染mc,沉默hsp70的表达,进一步验证hsp70对抗uvb损伤的作用。应用免疫荧光染色,观察hsp70在热处理或uvb辐射后的分布情况,探索hsp分布与dna损伤间的关系。结果:1、mc暴露于高剂量uvb辐射(100mj/cm2)后,可显著增加细胞dna的损伤(p0.001),降低mnsodmrna水平(p0.01)和总sod活力(p0.01);细胞内ros(p0.001)和mda(p0.001)水平增加;最终增加细胞凋亡(p0.001),降低mc活率(p0.001)。2、热处理后再照射uvb,可以显著降低uvb诱导的dna损伤(p0.05)和凋亡率(p0.001);与uvb组相比,联合处理可增加mnsodmrna的表达(p0.05),提高总sod活力(p0.01),降低mda(p0.001)和ros(p0.001)水平,最终增加mc的活率(p0.001)。3、hsp70的表达水平和dna的损伤程度呈负相关(r=-0.971,p0.001),而且hsp70特异性sirna可以沉默hsp70的表达,并且消除hsp70对uvb损伤的保护作用(p0.1)。4、即使在hsp70表达水平不增高的情况下,热处理刺激hsp70向细胞核和核仁转位,也可以减少dna损伤(p0.05);高剂量的atp(400μm)可以抑制hsp70向细胞核转位,进而消除热处理对细胞dna的保护作用(p0.1)结论:本实验显示,预先热处理的mc可以通过刺激hsp70的分布和表达,减轻uvb对dna的损伤作用,维持mnsod等抗氧化酶的表达,对抗氧化应激损伤,减少细胞凋亡,提高mc对uvb的耐受。研究证实,热处理联合uvb局部照射治疗白癜风,可以减少uvb诱导的多种损伤,具有良好的应用前景。
【关键词】：热处理 UVB 黑素细胞 氧化应激 Hsp70
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R758.41
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-13
• 文献回顾13-22
• 1. 白癜风和氧化应激13-18
• 2. 热休克蛋白 70（Hsp70）在应激性损伤中的作用18-22
• 实验一 热处理在UVB诱导的人黑素细胞损伤中的作用22-35
• 1 材料22-23
• 2 方法23-29
• 3 结果29-32
• 4 讨论32-35
• 实验二 热处理对UVB诱导黑素细胞损伤保护机制的研究35-52
• 1 材料35-39
• 2 方法39-42
• 3 结果42-50
• 4 讨论50-52
• 小结52-53
• 参考文献53-64
• 个人简历和研究成果64-65
• 致谢65

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本文编号：921197