红细胞膜包被聚合物纳米疫苗的制备及其对黑色素瘤的免疫治疗研究

发布时间：2017-09-26 04:06

  本文关键词：红细胞膜包被聚合物纳米疫苗的制备及其对黑色素瘤的免疫治疗研究

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【摘要】：肿瘤免疫治疗是通过激活抗原特异性的免疫应答,识别和杀灭肿瘤细胞,进而避免对正常细胞的损害,抑制肿瘤转移,预防复发。目前最广泛采用的树突状细胞(DC)疫苗是处理工序复杂,相应的临床效率较低(7%)。因此,需对DC疫苗体系进行改进,发展新型肿瘤疫苗。本研究构建一种以红细胞膜为基础的高效的新型还原响应多肽纳米载体,利用二硫键偶联实现亲水性多肽的包封和细胞内快速释放,结合红细胞促进抗原提呈和T细胞活化的能力,并通过引入DC靶向基团和加入佐剂增强机体的免疫应答。 以羧基端的PLGA为基础,通过三步反应合成PLGA-SS-hgp。核磁共振氢谱(1H-NMR)来表征化学结构,多肽的还原响应性和包封率则通过将纳米粒与还原剂二硫苏糖醇共孵育,HPLC梯度洗脱测定。采用机械挤出法制备红细胞膜包被的PLGA纳米粒(RBC-NP),通过在红细胞膜上插入磷脂DSPE-PEG-Man,生成磷脂插入的红细胞膜(Man-RBC)。采用TEM确定结构,并考察长期稳定性和血清稳定性,SDS-PAGE分析挤压前后蛋白的表达,Western blot检测CD58和CD59的表达。MTT法比较RBC-NP和Man-RBC-NP的细胞毒性,并对RBC-NP和Man-RBC-NP的摄取能力进行定性和定量检测。利用小动物活体成像考察体内组织分布行为及其对抗原贮库的影响。进一步观察甘露糖插入的红细胞膜包被的PLGA-SS-hgp纳米疫苗(Man-RBC-NPhgp)联合佐剂MPLA (M)对DC细胞熟化的影响,流式细胞仪检测CD86的表达,ELISA法测定炎性细胞因子的分泌。通过三种不同的动物模型(预防模型、治疗模型和肺转移模型)来研究此新型疫苗的抗肿瘤效应,并探讨此纳米疫苗的作用机制。最后,采用化疗药物与肿瘤疫苗相结合,评价二者单独及联合应用的抗肿瘤效应,并分析其可能的机制。 结果证明我们成功的合成了PLGA-SS-hgp聚合物,并通过HPLC确认了其还原敏感性。TEM显示RBC-NP具有特征性的核壳结构,在PBS和胎牛血清这两种介质中具有良好的稳定性。SDS-PAGE显示Man-RBC-NP和RBC-NP的蛋白表达和天然红细胞膜基本一致,Western blot证明挤出后RBC-NP仍存在CD58和CD59分子。RBC-NP和Man-RBC-NP均可以被DC2.4细胞和抗原提呈细胞(树突状细胞和巨噬细胞)有效摄取,而毒性实验显示其具有良好的生物相容性。Man-RBC-NP组的细胞摄取明显增强,具有较强的贮库效应,皮内注射24小时后主要分布在淋巴结。此纳米疫苗可以增强CD86表达和相关细胞因子的分泌。动物实验发现纳米疫苗能够延缓肿瘤出现,具有较好的抑制肿瘤和转移的效果,减少肿瘤组织中CD31的表达,降低肺组织中CD31和MMP2的表达,增强免疫小鼠体内IgG水平,上调荷瘤小鼠CTL的比例,促进免疫小鼠IFN-γ的分泌。而化疗与免疫结合可显著抑制肿瘤生长,增加DC和CTL在淋巴结细胞的比例,降低调节性T细胞(CD4+CD25+Foxp3+)表达,促进荷瘤小鼠IFN-γ的分泌。 总之,我们成功合成了还原响应性的多肽聚合物偶联物,构建红细胞膜包被的多肽聚合物纳米疫苗,具备相对较低的细胞毒性,易被抗原提呈细胞摄取,具有较好的贮库效应并可聚集在淋巴结,能诱导DC熟化,增加细胞因子分泌,体内预防及抗肿瘤治疗实验证明此纳米疫苗具有良好的黑色素瘤的预防和抗肿瘤及转移效果。 本课题成功设计了新型靶向树突状细胞的红细胞膜包被聚合物纳米疫苗,为探索黑色素瘤新型治疗方法提供了一定的理论依据。
【关键词】：免疫治疗 癌症疫苗 纳米颗粒 红细胞 树突状细胞
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.5;R730.51
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-13
• 前言13-21
• 参考文献18-21
• 第一部分 PLGA-SS-hgp的合成和表征21-33
• 引言21
• 材料和方法21-24
• 1. 实验材料21-22
• 2. 实验方法22-24
• 结果24-29
• 1. 核磁共振氢谱分析25-27
• 2. hgp100的标准曲线27-28
• 3. 还原性响应实验28-29
• 讨论29-31
• 参考文献31-33
• 第二部分 红细胞膜包被聚合物纳米粒的制备和表征33-44
• 引言33-34
• 材料与方法34-37
• 1. 实验材料34
• 2. 实验方法34-37
• 结果37-41
• 1. PLGA NP和RBC-NP的粒径及形貌比较37
• 2. PLGA NP和RBC-NP的长期稳定性和血清稳定性37-40
• 3. SDS-PAGE检测RBC-NP的蛋白表达40-41
• 讨论41-42
• 参考文献42-44
• 第三部分 红细胞膜包被PLGA纳米粒体外摄取和体内靶向性研究44-58
• 引言44-45
• 材料与方法45-49
• 1. 实验材料45-46
• 2. 试剂配制46
• 3. 实验方法46-49
• 结果49-54
• 1. 红细胞膜包被聚合物纳米粒的细胞摄取49-51
• 2. 红细胞膜包被聚合物纳米粒的细胞毒性评价51
• 3. 红细胞膜包被聚合物纳米粒的体内摄取试验51-52
• 4. 红细胞膜包被聚合物纳米粒的抗原贮库效应52-53
• 5. 红细胞包被聚合物纳米粒在小鼠的体内分布研究53-54
• 讨论54-56
• 参考文献56-58
• 第四部分 红细胞膜包被聚合物纳米疫苗对树突状细胞成熟的影响58-68
• 引言58
• 材料与方法58-62
• 1. 实验材料58-59
• 2. 试剂配制59
• 3. 实验方法59-62
• 结果62-65
• 1. BMDCs培养及光镜观察62-63
• 2. 流式细胞仪检测细胞表面CD86的表达63
• 3. 纳米疫苗对DC分泌细胞因子的影响63-65
• 讨论65-66
• 参考文献66-68
• 第五部分 红细胞膜包被聚合物纳米疫苗对肿瘤预防、治疗和转移的评价68-93
• 引言68-69
• 材料与方法69-73
• 1. 实验材料69-70
• 2. 试剂配制70
• 3. 实验方法70-73
• 结果73-87
• 1. 纳米疫苗对黑色素瘤的肿瘤预防作用73-74
• 2. 纳米疫苗对黑色素瘤的抑制作用74-79
• 3. 纳米疫苗对黑色素瘤转移的抑制作用79-84
• 4. 纳米疫苗对免疫小鼠血清中抗hgp100特异性抗体IgG的影响84
• 5. ELISPOT检测hgp100特异性效应T细胞84-86
• 6. 纳米疫苗对荷瘤小鼠CTL比例的影响86
• 7. 纳米疫苗对小鼠脾淋巴细胞杀伤活性的影响86-87
• 讨论87-90
• 参考文献90-93
• 第六部分 化疗与免疫治疗相结合治疗黑色素瘤的初步探索93-106
• 引言93
• 材料与方法93-96
• 1. 实验材料93-94
• 2. 实验方法94-96
• 结果96-102
• 1. 化疗与免疫相结合对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制96-99
• 2. 流式细胞仪检测淋巴结树突状细胞含量99
• 3. 流式细胞仪检测荷瘤小鼠淋巴结CTL表达99-100
• 4. 荷瘤小鼠脾脏Treg(CD4~+CD25~+Foxp3~+)的流式分析100-101
• 5. 荷瘤小鼠效应细胞对hgp100多肽的抗原特异性反应101-102
• 讨论102-104
• 参考文献104-106
• 综述106-129
• 参考文献122-129
• 发表的文章129-130
• 致谢130

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1 法祥光;;红细胞膜异常[J];国外医学.输血及血液学分册;1979年01期

2 潘华珍,张之南;红细胞膜与溶血[J];牡丹江医专学报;1982年02期

3 董伟;红细胞膜与疾病研究进展[J];生理科学;1988年05期

4 肖天庆;红细胞膜输氧作用与红细胞变形问题的初探(摘要)[J];生物医学工程学杂志;1988年03期

5 吴s，

本文编号：921356