信号转导和转录激活因子3在水痘—带状疱疹病毒复制过程中的作用和机制研究

发布时间：2017-09-29 12:27

  本文关键词：信号转导和转录激活因子3在水痘—带状疱疹病毒复制过程中的作用和机制研究

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【摘要】：研究背景和目的水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus, VZV)属疱疹病毒α亚科,是双链DNA病毒。人类对VZV普遍易感,VZV主要是通过呼吸道和密切接触传播,感染后可以引起水痘和带状疱疹两种截然不同的疾病。VZV初次感染后病毒并不能被机体完全清除,而是潜伏在脊髓神经节或三叉神经节的感觉神经细胞内。在机体免疫力低下时可被再次激活从而引发带状疱疹,临床以沿单侧肢体分布的红斑水疱伴有疼痛为特征。部分患者可出现严重疼痛甚至后遗神经痛。水痘及带状疱疹为临床常见病。然而,作为VZV发病机制重要组成的一部分,VZV复制机制的研究至今仍然较为匮乏。微小RNA (microRNA, miRNA)在基因转录后水平调控基因表达,是一类长度为21～24 (nucleotide, nt)的非编码小RNA,参与了多种生物学信号通路的调节。miRNA可以控制多种生物进程,如细胞的增殖,凋亡和分化。越来越多的证据表明,miRNA的异常表达参与了肿瘤的发生,发展。除此之外,miRNA在影响病毒复制方面,许多研究证明mi RNA具有不同的作用和影响。miR-181抑制呼吸综合征病毒；miR-17-29干扰HBV而miR-501增强HBV的产生,而不是抑制复制,两者间的关系就像相同组织中miR-126和柯萨奇病毒之间相互作用的关系。然而,至今只有少量研究关于miRNA与VZV复制之间的关系。信号转导及转录激活因子家族(signal transducerand activaye of transcription, Stats)是一类由生长因子、细胞因子等多肽类配体激活的转录因子。共有7个成员,其中stat3是较为活跃的一个。Stat3是一种具有致癌潜能的转录因子。Stat3有7个主要部分：①保守的氨基端序列,为Stat3和其他转录因子之间相互作用、Stat3二聚体的形成以及和细胞因子受体间结合等所必需；②位于727位的丝氨酸磷酸化位点,可激活Stat3,使STAT途径与Ras途径产生相互联系；③位于羧基端第705位的酪氨酸磷酸化位点,该位点磷酸化以后可使Stat3活化,移入细胞核以后可以激活靶基因的转录；④位于第400-500位氨基酸之间DNA结合区,为高度保守；⑤羧基端,该区域有两种不同的剪接方式,形成了Stat3α和Stat3β,这一区域含有转录激活区；⑥位于第500-600位氨基酸之间保守性较差的SH3区,功能尚不清楚；⑦位于第600-700位氨基酸之间的SH2区,其功能是促使Stat3分子与活化的受体形成复合物,介导Ja-nus激酶-STAT间的相互作用,使Stat3形成二聚体,移入细胞核,调节基因表达。在生理状态下,Stat3的激活是快速并且短暂的,对生理功能起着关键性作用。病理状态下,Stat3属于一种致癌基因,具有强烈的抑制细胞凋亡,促进细胞增殖的作用。此外,Stat3在病毒发病机制中起重要作用,如γ-疱疹,卡波西肉瘤疱疹病毒(KSHV),以及Epstein-Barr病毒(EBV)。最近研究发现,VZV触发Stat3信号传导途径,并且根据抗凋亡蛋白生存素依赖机制激活的Stat3增加VZV复制。干扰素(inteferin, IFNs)是一种重要的抗病毒免疫反应的细胞因子,按照其来源和功能,可将其分为三类。IFN-Ⅰ包括IFN-α和IFN-β,可产生于大部分类型细胞中,具有抗病毒活性。IFN-ω、ε、κ、δ和τ也属于Ⅰ型干扰素,但它们的表达依细胞类型和物种特异性而不同。Ⅰ型干扰素通过受体IFNAR1/2向胞内传递信号。Ⅰ型干扰素参与诱导多条信号通路,如Jak—Stat途径,CRKL途径；PI3K途径；MAPK途径。很多病毒对Ⅰ型干扰素非常敏感,Ⅰ型干扰素可以在病毒复制的任何阶段发挥作用。Ⅰ型干扰素抗病毒的功能是通过干扰素诱导产生的功能蛋白因子来实现的,其中研究较多的包括PKR,ADAR,OAS (2c,5c-oligoadenylate synthetase),RNase L以及Mx。除了干扰素诱导的抗病毒蛋白之外,Ⅰ型干扰素也能够通过调节诸如NK细胞、T细胞等重要的免疫细胞来发挥功能。根据上述研究基础,我们推测在VZV感染的情况下,是否存在VZV、miRNA. Stat3及IFN四者之间的某种联系。这是一个值得研究的课题,其意义在于探究VZV复制的机制,可以于患病早期,尤其是对于老年带状疱疹患者可给与积极治疗,以减轻后遗神经痛的发病,为临床治疗提供新的思路。方法(1)在人胚肺成纤维细胞(HELF)细胞株中感染VZV病毒,与未感染者进行对比,使用实时荧光定量聚合酶链反应法(qRT-PCR)进行测定,比较micro RNA-21、Stat3及抗凋亡蛋白存活素(survivn)的表达情况。(2)在VZV感染的HELF中,按照OnM、25nM、50 nM、00 nM、 200 nM的浓度逐级递增microRNA-21模拟物,利用空斑病毒检测法检测VZV病毒滴度。(3)在HELF细胞株中转染microRNA-21模拟物,同时对部分样本转染miR-对照,使用qRT-PCR方法,利用GAPDH作为内部参照,检测Stat3和survivn的mRNA表达情况。(4)在HELF细胞感染VZV后,将microRNA-21的模拟物和沉默Stat3基因转染HELF细胞。本实验分为4组,分别命名为21+shStat3(细胞共转染+microRNA-21的模拟物+Stat3沉默基因)、21+shcontrol(细胞共转染-mi RNA-21-模拟物和+对照沉默基因), micro对照+ shSTAT3(细胞共转染+ miRNA对照+Stat3沉默基因),micro对照+shcontrol(细胞共转染+ miRNA对照+-对照沉默基因)。Stat3蛋白的表达通过Western blotting (WB)方法检测(以判断Stat3是否有效被沉默),观察组间microRNA-21表达情况,及病毒滴度的变化。(5)VZV感染HELF细胞,应用WB方法检测Stat3的表达；(6)通过对感染VZV的HELF细胞转染质粒,形成Stat3过表达组及Stat3沉默组,使用空斑病毒滴度检测法分别检测未转染质粒组(VZV+HELF)及上述两组(VZ V+HELF+upSTAT3组和VZV+HELF+siSTAT3组)的VZV滴度,并用qRT-PCR检测IFN-Ⅰ的功能蛋白(OAS、PKR、IRF3和STAT1)的表达情况。(7)在VZV+HELF,VZV+HELF+upSTAT3组和VZV+HELF+siSTAT3三组中,分别按照0,25,50, 100U/ml加入IFN,检测VZV滴度。在三组中,分别加入25ng/ml的IFN Ab,检测VZV滴度。结果(1)microRNA-21的表达水平在HELF细胞株感染VZV后上调(p=0.000)；感染组Stat3的相对mRNA表达高于未感染组(P=0.000)。(2)在HELF细胞中,病毒滴度随microRNA-21模拟物浓度的增高而增高,两者呈正相关。但当microRNA-21模拟物在200nM的浓度时,病毒滴度没有显著增加。(3)在转染microRNA-21的模拟物的HELF细胞中,Stat3的mRNA表达(P=0.000)和survivn(P=0.000)水平都得到提高。(4) microRNA-21在21+shStat3和21+shcontrol两组中具有较高的表达,明显优于其他两组；在21+shStat3和对照+shStat3两组中,Stat3蛋白的表达量极低,说明Stat3有效被沉默。4个组中病毒平均滴度分别为3.47×102 PFU/ml (21+shStat3),1.48×107PFU/ml (21+shcontrol),1.82×102 PFU/ml(对照+shStat3),3.23×104PFU/ml(对照+shcontrol)。miR-21的过度表达刺激VZV的复制,直到Stat3基因沉默。(5)VZV感染后,Stat3表达显著。Stat3的过度表达增加了VZV感染(upSTAT3 VS upcontrol, P0.001),同时,干扰素反应基因(OAS (P=0.000), PKR (P =0.000), IRF3 (P=0.000)和STAT1 (P=0.000))在upSTAT3中都有衰减。(6)VZV感染HELF后24小时,沉默Stat3组病毒滴度显著降低(p=0.007),且Ⅰ型IFN反应基因OAS (P=0.000), PKR (P=0.000)、IRF3 (P=0.000)和STAT1 (P=0.000)上调。(7)在正常HELF细胞和Stat3沉默细胞中,干扰素以一种剂量依赖(0,25,50,100U/ml)的方式降低VZV复制。用25ng/ml的干扰素抗体处理细胞时,VZV效价达到很高的水平。结论1) microRNA-21、Stat3均可促进VZV复制,microRNA-21过表达可上调Stat3,促进VZV的复制。2) Stat3基因过表达可以显著抑制IFN-Ⅰ对VZV感染的作用。沉默Stat3时,IFN-Ⅰ对VZV感染的反应增强。Stat3在VZV感染过程中抑制IFN-Ⅰ介导的抗病毒反应。3) Stat3可通过抑制IFN-1介导的抗病毒反应促进VZV复制,同时microRNA-21可上调Stat3基因的表达,microRNA-21、Stat3二者在病毒感染过程中协同促进VZV复制。
【关键词】：信号转导及转录激活因子3 微小RNA-21 Ⅰ型IFN 水痘-带状疱疹病毒(VZV)
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R752.12;R511.5
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-20
• 第一章 微小RNA-21通过触发信号转导和转录激活因子3影响水痘-带状疱疹病毒20-56
• 1. 材料、试剂、仪器20-27
• 2. 实验方法27-39
• 3. 结果39-46
• 4. 讨论46-49
• 结论与展望49-51
• 参考文献51-56
• 第二章 STAT3抑制VZV感染诱导的Ⅰ型干扰素反应56-77
• 1. 材料、试剂、仪器60-67
• 2. 实验方法67-69
• 3. 结果69-75
• 4. 讨论75-77
• 全文总结77-78
• 参考文献78-82
• 综述一 Stat3与相关皮肤病研究进展82-91
• 参考文献88-91
• 综述二 MicroRNA与肿瘤91-100
• 参考文献96-100
• 缩写词简表100-101
• 致谢101-102
• 博士研究生期间发表论文情况102-103

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