光老化人真皮成纤维细胞通过“旁观者效应”对正常人真皮成纤维细胞氧化损害、增殖、老化及自噬活性的影响

发布时间：2017-09-30 17:10

  本文关键词：光老化人真皮成纤维细胞通过“旁观者效应”对正常人真皮成纤维细胞氧化损害、增殖、老化及自噬活性的影响

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【摘要】：研究背景皮肤的老化是由内源性和外源性因素决定的,外源性因素如太阳辐射、吸烟或污染,其中太阳辐射占主要作用,故常将外源性因素引起的老化称为光老化。体外培养的正常细胞经过紫外线照射等应激刺激可出现提早衰老称为应激诱导的提前衰老(Stress-induced premature senescence,SIPS)。我们及国内外等多个研究小组均通过连续多次中波紫外线(Ultraviolet B,UVB)照射HDFs成功构建了UVB诱导的提前衰老细胞模型(UVB-SIPS)。放射学家将直接受损伤细胞将所受损害传播至其他没有直接受损细胞的现象称为旁观者效应。近些年来,已有多名学者证明,经紫外线单次照射的人真皮成纤维细胞(Human dermal fibroblasts,HDFs)通过旁观者效应使周围成纤维细胞发生诸如增殖活性降低、DNA损伤、周期阻滞等各种生物学表现。然而,对于光老化人真皮成纤维细胞能否通过旁观者效应影响其周围正常人真皮成纤维细胞尚未见报道。目的研究光老化人真皮成纤维细胞能否通过“旁观者效应”对正常人真皮成纤维细胞的增殖、老化及自噬等产生影响及其机制。方法1.HDFs的分离与培养从本院泌尿外科手术室获取健康青壮年男性包皮环切术后的组织后分离表真皮,对获得的HDFs正常培养,取处于对数生长期的4~10代细胞进行实验。2.uvb-sips造模将处于对数生长期的4~10代hdfs进行每天1次10mj/cm2uvb照射,连续照射5天后,静置3天。3.细胞培养上清液的收集正常培养2-3天未经处理的hdfs及光老化hdfs后,分别收集各组培养上清液,即正常成纤维细胞培养上清液(conditionedmediumofnormalfibroblasts,fb-cm)及uvb诱导的提前衰老的成纤维细胞培养上清液(conditonedmediumofphotoagingfibroblasts,ph-cm),收集后放入-80℃冰箱中备用。4.ph-cm对hdfs的氧化损害将ph-cm孵育正常hdfs4天后,使用细胞荧光染色法和流式细胞术检测细胞中活性氧及线粒体膜电位的水平。5.ph-cm对hdfs增殖的影响将ph-cm孵育正常hdfs20天后,使用cck-8法及edu染色法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期。6.ph-cm对hdfs提前衰老的影响将ph-cm孵育正常hdfs20天后,使用衰老相关的β-半乳糖苷酶(senesceneassociated-β-galactosidase,sa-β-gal)化学染色法检测细胞衰老。7.ph-cm对hdfs自噬活性的影响将ph-cm孵育正常hdfs20天后,使用吖啶橙染色法检测细胞自噬水平、细胞免疫荧光染色法及蛋白质印迹法(westernblot,wb)检测细胞自噬相关蛋白lc3-b的表达。结果1.ph-cm可加剧hdfs的氧化损害细胞荧光染色法及流式细胞术结果提示:ph-cm孵育组培养体系中的hdfs的活性氧水平及线粒体膜电位去极化水平均高于fb-cm孵育组,两组数据差异有统计学意义(p0.05)。培养基中加入抗氧化剂n-乙酰-l-半胱氨酸(nacetyllcysteine,nac)可减轻ph-cm对hdfs的氧化损害。2.ph-cm可抑制hdfs增殖cck-8结果显示ph-cm孵育组细胞增殖活性较fb-cm孵育组明显下降,两组数据差异有统计学意义(p0.05);细胞周期结果显示ph-cm组g1期细胞百分比明显低于对照组,两组数据差异有统计学意义(P0.05);EDU染色结果提示PH-CM组S期细胞百分比明显高于对照组,两组数据差异有统计学意义(P0.05)。3.PH-CM可加速HDFs衰老表型PH-CM孵育组中HDFs的SA-β-Gal染色阳性率明显高于FB-CM孵育组,两组数据差异有统计学意义(P0.05)。4.PH-CM可抑制HDFs自噬吖啶橙染色结果显示PH-CM孵育组HDFs自噬小泡荧光量低于FB-CM孵育组,两组数据差异有统计学意义(P0.05);Western印迹及细胞免疫荧光结果均显示PH-CM孵育组中HDFs的LC3-B表达量低于对照组,两组数据差异有统计学意义(P0.05)。结论光老化人真皮细胞可通过“旁观者效应”加剧正常人真皮成纤维细胞氧化损害导致后者增殖减缓、老化加速及自噬减少。
【关键词】：中波紫外线 旁观者效应 氧化损害 增殖 自噬
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R751
【目录】：

• 全文主要缩略语4-5
• 全文技术流程图5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-16
• 材料与方法16-33
• 结果33-40
• 讨论40-45
• 全文小结45-46
• 参考文献46-49
• 综述49-56
• 参考文献53-56
• 攻读学位期间发表文章情况56-57
• 致谢57-58

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本文编号：949405