载4HPR脂质微泡的制备及其联合超声对瘢痕疙瘩的作用研究

发布时间：2017-10-07 19:22

  本文关键词：载4HPR脂质微泡的制备及其联合超声对瘢痕疙瘩的作用研究

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【摘要】：目的制备载N-(4-羟基苯基)维生素甲酰胺[N-(4-hydroxyphenyl)retinamide,4HPR]脂质微泡(4HPR-loaded lipid microbubbles,4HPR-LM),并探讨其联合超声(Ultrasound,US)对瘢痕疙瘩的作用。方法采用薄膜-超声分散法制备载4HPR脂质体(4HPR-loaded liposome,4HPR-L),并采用单因素考察及正交试验对4HPR-L的制备条件及处方加以优化;在4HPR-L的基础上采用超声空化法制备4HPR-LM,通过透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)法、动态光散射法及 HPLC(high-performance liquid chromatograph,HPLC)法,对其外观形态、粒径分布、Zeta电位、包封率、载药量、物理稳定性、温度及超声敏感性等制剂学性质进行了考察。通过MTT比色实验对体外实验超声参数进行优化,采用激光共聚焦显微镜法观察香豆素-6脂质微泡的入胞情况,通过细胞增殖抑制试验分别评价空白脂质微泡(Blank-loaded lipid microbubbles,Blank-LM)的生物相容性及游离 4HPR、单纯 4HPR-LM、4HPR-LM联合超声的细胞增殖抑制作用,采用AnnexinV-FITC/PI双染法和Hoechst33258荧光染色法观察游离4HPR及4HPR-LM联合超声诱导人瘢痕疙瘩成纤维细胞(Human Keloid Fibroblasts,HKFs)的凋亡情况。建立裸鼠瘢痕疙瘩皮下移植瘤模型,观察游离4HPR及4HPR-LM联合超声的体内抑瘤作用,并对其应用安全性进行评价。结果优化实验确定制备条件为:三氯甲烷2 ml,旋蒸30 min,水浴温度50℃,转速120 rpm/min,5%葡萄糖溶液8 ml,旋转水化溶胀时间20 min,探头超声时间5 min,过0.22 μm滤膜次数 7 次;脂质体处方为:EPC:Chol(g:g)为 11:1、4HPR 为 3mg、mPEG-DSPE2000为3 mg:制备的4HPR-L透射电镜下显示为大小均匀、外观圆整的球形或类球形结构:马尔文粒径仪检测显示平均粒径为(122.87±5.06)nm,Zeta电位为(-43.8±1.0)mV,密封保存(4℃)30天外观、平均粒径和Zeta电位均无明显变化,7 d、15 d、30 d其渗漏率分别为(1.30±0.89)%、(3.15±0.75)%、(5.88±0.63)%,说明制备的 4HPR-L 4℃冰箱内密封保存 30d稳定性良好;4HPR-LM平均粒径为(113.80±3.27)nm,Zeta电位为(-35.5±1.10)mV,包封率为(94.48±1.05)%,载药量为(8.31±0.33)%,具有一定的温度及超声敏感性,为其超声辐照下体内释药提供了理论支撑。MTT实验确定体外实验超声参数设置为3 MHz,0.7 w/cm2,60s;激光共聚焦实验显示脂质微泡的入胞速度很快,在10 min内基本能进入细胞,而超声辐照能促进入胞作用;细胞增殖抑制试验显示在本实验范围内,Blank-LM对HKFs的抑制率均在9.67%以内,表明载体材料的生物相容性良好;4HPR及4HPR-LM对HKFs的生长增殖作用均表现出浓度及时间依赖性,相比于游离4HPR,4HPR-LM能更有效地抑制HKFs的生长增殖,组间比较有统计学差异(P0.05),而4HPR-LM联合超声辐照相比于游离4HPR及单纯4HPR-LM则表现出更强地抑制HKFs的生长增殖作用,各组间比较差异均有显著统计学差异(P0.01);细胞凋亡实验显示,与游离4HPR相比,4HPR-LM联合超声能更有效地诱导HKFs的凋亡(P0.01)。4HPR-LM联合超声亦较游离4HPR表现出更好地抑制人瘢痕疙瘩组织块生长的效果(P0.01),所有裸鼠心、肝、脾、肾HE染色均未见明显器质性变化,在整个实验过程中所有裸鼠一般状态均良好,体重无明显差异,未见明显不良反应发生。结论 制备的4HPR-L稳定性良好,能对疏水性极强的4HPR进行良好的包封,极大地提高了 4HPR的水溶性,为4HPR的进一步研究奠定了良好的基础;最终制备的4HPR-LM联合超声辐照在体内外实验中显示出较好地抑制HKFs生长增殖、诱导凋亡及抑制瘢痕疙瘩生长的作用。4HPR-LM联合US是一种有效提高药物疗效的方法,有望成为治疗瘢痕疙瘩的一种新途径,值得进一步深入研究。
【关键词】：4HPR 脂质体 微泡 超声 瘢痕疙瘩
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 中英文对照表13-14
• 第一章 前言14-16
• 第二章 载4HPR脂质体及载4HPR脂质微泡的制备与表征16-42
• 第一节 载4HPR脂质体中药物含量及包封率检测方法的建立16-23
• 2.1 实验仪器与材料16
• 2.2 实验方法16-18
• 2.2.1 HPLC检测波长的选择16
• 2.2.2 4HPR含量体外检测色谱条件16-17
• 2.2.3 4HPR含量测定标准曲线的绘制17
• 2.2.4 专属性实验17
• 2.2.5 精密度实验17
• 2.2.6 4HPR-L包封率检测方法的建立17-18
• 2.3 实验结果与讨论18-22
• 2.3.1 4HPR紫外扫描结果图18-19
• 2.3.2 4HPR体外含量测定标准曲线19
• 2.3.3 专属性实验19-20
• 2.3.4 精密度实验20
• 2.3.5 4HPR脂质体包封率检测方法的建立20-22
• 2.4 小结22-23
• 第二节 载4HPR脂质体制备工艺及处方的优化23-35
• 2.1 实验仪器与材料23
• 2.2 实验方法23-26
• 2.2.1 载4HPR脂质体的制备23
• 2.2.2 单因素考察优化制备工艺23-24
• 2.2.3 处方的单因素考察24-25
• 2.2.4 处方的正交实验25
• 2.2.5 工艺重现性考察25-26
• 2.3 实验结果与讨论26-34
• 2.3.1 制备条件的单因素考察26-31
• 2.3.2 处方的单因素考察31-32
• 2.3.3 处方的正交优化设计实验结果32-33
• 2.3.4 工艺重现性33-34
• 2.4 小结34-35
• 第三节 载4HPR脂质体及载4HPR脂质微泡的制备及质量评价35-42
• 2.1 实验仪器与材料35
• 2.2 实验方法35-36
• 2.2.1 4HPR-L的制备35
• 2.2.2 4HPR-LM的制备35
• 2.2.3 4HPR-L与4HPR-LM包封率的对比35
• 2.2.4 4HPR-L与4HPR-LM的表征35-36
• 2.3 实验结果与讨论36-40
• 2.3.1 4HPR-L与4HPR-LM包封率的对比36-37
• 2.3.2 4HPR-L与4HPR-LM的表征37-40
• 2.4 小结40-42
• 第三章 4HPR-LM联合超声对瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用研究42-54
• 3.1 实验仪器与实验材料42
• 3.2 实验方法42-45
• 3.2.1 入瘢痕疙瘩成纤维细胞的原代培养42-43
• 3.2.2 细胞传代43
• 3.2.3 细胞生长曲线43
• 3.2.4 体外实验超声参数的筛选43-44
• 3.2.5 细胞摄取试验44
• 3.2.6 细胞增殖抑制试验44
• 3.2.7 细胞凋亡试验44-45
• 3.2.8 统计学方法45
• 3.3 实验结果与讨论45-53
• 3.3.1 原代培养瘢痕疙瘩成纤维细胞生长状况45-46
• 3.3.2 细胞生长曲线46
• 3.3.3 超声参数筛选46-47
• 3.3.4 细胞摄取试验47-48
• 3.3.5 细胞增殖抑制试验48-51
• 3.3.6 细胞凋亡试验51-53
• 3.4 小结53-54
• 第四章 4HPR-LM联合超声对瘢痕疙瘩裸鼠皮下移植瘤的作用研究54-58
• 4.1 实验仪器和实验材料54
• 4.2 实验方法54-55
• 4.2.1 瘢痕疙瘩裸鼠皮下移植瘤模型的建立54
• 4.2.2 4HPR-LM联合超声体内抑制瘢痕疙瘩生长作用及初步安全性评价54
• 4.2.3 统计学方法54-55
• 4.3 实验结果和讨论55-57
• 4.3.1 瘢痕疙瘩裸鼠皮下移植瘤模型的评估55
• 4.3.2 瘢痕疙瘩裸鼠皮下移植瘤块体积变化55-56
• 4.3.3 瘢痕疙瘩裸鼠皮下移植瘤块组织学变化56
• 4.3.4 初步安全性评价56-57
• 4.4 小结57-58
• 第五章 结论58-59
• 参考文献59-64
• 致谢64-65
• 综述65-74
• 参考文献70-74

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