USP39在黑色素瘤增殖中的作用和机制研究

发布时间：2017-10-07 23:27

  本文关键词：USP39在黑色素瘤增殖中的作用和机制研究

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【摘要】：黑色素瘤是一种起源于黑色素细胞的恶性肿瘤,其恶性程度极高,预后较差。对于早期黑色素瘤患者予以手术切除后,仍有较高的复发和转移率。而晚期的黑色素瘤患者接受放疗和化疗的结果都很不令人满意。近年来,抑制致病基因的靶向治疗药物显著提高了患者的生存率。但是,对靶向药物的原发和继发性耐药是黑色素瘤治疗中的一个棘手的问题。因此,亟需寻找新的针对黑色素瘤的治疗靶点,以建立个性化的治疗方案,提高患者生存率。近年来,研究发现除了蛋白质激酶外,物质代谢、RNA剪切、免疫系统及表观遗传学等多个生物学过程均在肿瘤的发生发展中起到了非常重要的作用。参与这些过程的各种因子都可能是潜在的肿瘤药物作用靶点。剪接体(Spliceosome)参与前体m RNA的编辑,近年来研究表明其与肿瘤的发生、发展有密切的联系。真核生物断裂基因,先转录成包含非编码区的前体m RNA(pre-m RNA),在剪接的协助下,去除内含子,并将外显子进行连接后,进而形成成熟的m RNA。剪接体由小分子核糖核蛋白(sn RNP)和近百种蛋白质组成的一种特异的RNA-蛋白质复合体。每一种sn RNP(U1,U2,U4/U6,and U5)包含一种富含嘧啶碱基的核小RNA(sn RNA)。在m RNA剪接过程中,U1、U2 sn RNP先在pre-m RNA上定位,招募U4/U6sn RNP和U5sn RNP形成U4/U6-U5 tri-sn RNP复合物完成剪接体组装。此时,U1、U4脱离pre-m RNA,剪接体发生酶促反应切除基因的内含子并连接外显子。完成反应后,剪接体的各部分也相应解离释放,以便重复利用。m RNA的剪接对包括细胞周期、信号转导及凋亡在内的许多基因的表达有重要影响。近年来,多种肿瘤中发现剪接体相关基因存在突变和表达异常,其中包括SF3B1,ZRSR2,U2AF1,SRSF2等。剪接体相关基因可能成为一个潜在的肿瘤治疗靶点。USP39是一种去泛素化酶,属于泛素蛋白特异性蛋白酶家族中的一员。USP39基因及其编码的蛋白质结构是高度保守的。在人类,小鼠,斑马鱼及酵母中该基因有高度的同源性。USP39蛋白由一个锌指泛素结合结构域和一个泛素蛋白特异性蛋白酶结构域组成。由于USP39缺乏三个主要的酶活性位点,所以USP39缺乏泛素蛋白酶活性。功能学研究提示USP39对招募U4/U6-U5 tri-sn RNP定位于剪接体前体有重要作用,但其对维持U4/U6-U5 tri-sn RNP的稳定性不是必需的。缺乏USP39则无法形成成熟的剪接体。通过对USP39的晶体结构进行分析提示其Zn F-UBD结构域与USP家族其他成员的Zn F-UBD结构域结构相似,功能学预测USP39的Zn F-UBD结构域可能起到激活其邻近的USP结构域的作用。近年研究提示,USP39在乳腺癌、肝癌及甲状腺癌中高表达。在肿瘤细胞中,沉默USP39可导致细胞周期阻滞,并诱导细胞凋亡。可见,USP39扮演着癌基因的角色,并可能成为一个潜在的肿瘤治疗靶点。而其在黑色素瘤中尚无人研究,因而有必要进行深入研究探讨。目的:1、检测USP39在黑色素瘤中的表达情况,分析其表达水平与临床病理学特征间的相关性,探讨其潜在的临床价值。2、研究USP39在黑色素瘤增殖表型中的作用。3、探讨USP39影响黑色素瘤增殖表型的可能分子机制。方法:1、利用免疫组织化学染色检测USP39在黑色素瘤组织及良性痣组织中的表达情况,统计分析其表达水平与临床病理学特征之间的相关性,揭示USP39潜在的临床应用价值;2、构建包装USP39特异性的sh RNA慢病毒(Lv-sh USP39)和相应的阴性对照慢病毒(Lv-sh Ctrl)。3、应用上述慢病毒感染A375和M14细胞,筛选获得稳定转染株,Real time q PCR和Western blot证实其沉默USP39表达的有效性;4、采用MTT实验、平板克隆形成实验检测USP39沉默对A375和M14细胞体外增殖能力以及克隆形成能力的影响;5、采用流式细胞术检测USP39沉默对A375和M14细胞在细胞周期和细胞凋亡方面的影响;6、应用裸鼠体内成瘤模型观察USP39沉默对A375细胞体内成瘤能力的影响;7、应用Western blot方法检测细胞周期、细胞凋亡关键调控分子及MAPK/ERK通路关键分子ERK1/2的表达变化,初步探讨USP39影响黑色素瘤细胞增殖的分子机制。结果:1.我们用免疫组化的方法检测了70例黑色素瘤组织和50例良性痣组织USP39表达情况。结果表明,在70例黑色素瘤组织中,USP39蛋白表达的阳性率为95.7%(67/70),其中强阳性21例,中等强度阳性29例,弱阳性17例,阴性3例;而在50例良性痣组织中,USP39蛋白表达无强阳性者,中等强度阳性11例,弱阳性率为20例,阴性率19例。统计学分析提示USP39在黑色素瘤组织表达明显高于与良性痣组织(p0.01)。但是,进一步分析提示USP39在黑色素瘤组织中的表达与患者的年龄、性别、部位、有无溃疡及转移与否之间均无显著性差异(P0.05)。2.为了探讨USP39对黑色素瘤细胞A375和M14增殖表型的影响,我们成功构建了USP39特异性的sh RNA慢病毒(Lv-sh USP39)和相应的阴性对照(Lv-sh Ctrl)。用其感染A375和M14细胞后,Real time q PCR和Western blot证实USP39的表达水平明显下调。3.MTT实验显示,Lv-sh USP39感染的A375和M14细胞,其生长速度明显慢于Lv-sh Ctrl感染的细胞(P0.01)。平板克隆形成实验表明,与Lv-sh Ctrl感染的A375和M14细胞相比,Lv-sh USP39感染的细胞克隆形成能力明显降低、克隆形成数目明显减少,差异具有统计学意义(P0.01)。4.流式细胞仪检测细胞周期结果显示,相对于阴性对照组细胞,USP39沉默组的A375和M14细胞G0/G1期细胞明显增加(P0.05),G2/M期细胞百分比则显著降低(P0.01)。USP39沉默导致黑色素瘤细胞G0/G1期阻滞。5.流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,相对于阴性对照组,USP39沉默组的A375和M14细胞细胞凋亡明显增加(P0.01)。USP39沉默诱导黑色素瘤细胞凋亡。6.裸鼠成瘤实验结果提示Lv-sh USP39感染的A375细胞在裸鼠体内所形成的肿瘤体积和重量明显小于于Lv-sh Ctrl感染的细胞,差异具有统计学意义(P0.01)。7.Western blot结果提示,USP39沉默可以上调p21和p27的表达,下调Cyclin D1和CDK4的表达。同时,Western blot结果提示也提示,USP39沉默可以减少Bcl-2表达,增加Bax的表达,降低Bcl-2/Bax的比率。进一步研究结果提示,USP39沉默后p-ERK1/2表达明显下调。结论:本研究首次发现USP39在黑色素瘤组织中呈现普遍高表达,但其表达水平与患者的年龄、性别、发病部位、有无溃疡及转移与否之间无明显关联。沉默USP39可以抑制黑色素瘤细胞的体内、体外增殖,诱导G0/G1期阻滞并促进细胞凋亡。沉默USP39可以影响黑色素瘤细胞中周期、凋亡相关蛋白的表达,上调p21、p27和Bax的表达,同时下调Cyclin D1、CDK4和Bcl-2的表达。USP39沉默后p-ERK1/2表达明显下调,提示其可能通过MAPK/ERK通路影响黑色素瘤的恶性增殖。总之,这些结果提示USP39在黑色素瘤的发生发展中可能扮演促癌基因的角色,同时也为USP39作为治疗中晚期黑色素瘤的潜在靶点提供了实验证据。
【关键词】：黑色素瘤 USP39 增殖 细胞周期 细胞凋亡
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 中英文缩写词对照7-9
• 中文摘要9-13
• ABSTRACT13-18
• 1. 前言18-24
• 2. 实验材料24-34
• 2.1 患者来源及临床资料24-26
• 2.2 细胞株26
• 2.3 慢病毒质粒载体26
• 2.4 实验动物26-27
• 2.5 主要试剂27-30
• 2.6 主要仪器30-31
• 2.7 溶液和试剂的配制31-34
• 3 实验方法34-51
• 3.1 免疫组化34-35
• 3.2 质粒构建35-39
• 3.3 病毒包装39
• 3.4 病毒收获和浓缩及滴度测定39-40
• 3.5 细胞培养40-41
• 3.6 病毒感染41
• 3.7 实时荧光定量PCR（Real time qPCR）41-44
• 3.8 Western blot44-47
• 3.9 MTT法测细胞增殖47-48
• 3.10 平板克隆形成实验48
• 3.11 流式细胞术检测细胞周期48-49
• 3.12 细胞凋亡检测（Annexin V-APC/PI双染法）49
• 3.13 裸鼠成瘤实验49-50
• 3.14 统计学方法50-51
• 4. 结果51-66
• 4.1 免疫组化分析USP39在黑色素瘤标本中的表达及其与临床病理资料的相关性51-53
• 4.2 USP39特异性shRNA表达载体的构建及其相应慢病毒的制备53-56
• 4.3 慢病毒介导的USP39基因表达沉默对黑色素瘤细胞增殖的影响56-62
• 4.4 慢病毒介导的USP39基因表达沉默对黑色素瘤细胞增殖抑制作用的体内实验62-63
• 4.5 USP39对黑色素瘤细胞增殖影响的机制研究63-66
• 5. 讨论66-75
• 6. 结论75-76
• 参考文献76-85
• 附录85-86
• 致谢86-88
• 综述88-107
• 参考文献96-107

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 Miguel Angel Chiurillo;;Role of the Wnt/β-catenin pathway in gastric cancer: An indepth literature review[J];World Journal of Experimental Medicine;2015年02期

2 Xiao-Xin Sun;Mu-Shui Dai;;Deubiquitinating enzyme regulation of the p53 pathway: A lesson from Otub1[J];World Journal of Biological Chemistry;2014年02期

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本文编号：990706