低氧微环境促进OM-MSCs增殖及向多巴胺能神经元分化的研究

发布时间：2017-10-09 20:28

  本文关键词：低氧微环境促进OM-MSCs增殖及向多巴胺能神经元分化的研究

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【摘要】：目的：研究低氧微环境是否能促进嗅黏膜间充质干细胞(OM-MSCs)增殖和低氧微环境下利用嗅鞘细胞(OECs)上清液诱导OM-MSCs向多巴胺能神经元分化及其相关的机制。方法：1. OM-MSCs和OECs培养与鉴定：分离培养OM-MSCs和OECs,应用流式细胞学、Western Blot及免疫荧光方法对两种细胞分别进行鉴定。2. OM-MSCs在低氧微环境下增殖：实验将含10%FBS培养基培养的OM-MSCs分成三组：3% O2+YC-1 (HIF-1α抑制剂)组、3%O2组、21%O2组(常氧组),共同培养72h后先对细胞核进行免疫荧光染色、细胞流式检测细胞增殖及凋亡情况,再应用Western blot方法检测各组增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达的情况。3. OM-MSCs在低氧微环境下用OECs上清液诱导其分化：实验将OM-MSCs分为另外三组：3%O2+YC-1+OECs上清诱导组(低氧A组)、3%O2+OECs上清诱导组(低氧B组)及21%O2+OECs上清诱导组(常氧对照组),用免疫荧光检测分化后的多巴胺能神经元,用Q-PCR及Western blot分别检测各组mRNA及蛋白表达情况,最后用膜片钳检测分化的神经元离子通道开放情况及ELISA检测分化后细胞上清中多巴胺的含量。结果：1. OM-MSCs和OECs培养与鉴定：分离培养出了OM-MSCs和OECs,并应用流式细胞学检测出OM-MSCs的纯度达99%；对培养的OECs用免疫荧光进行鉴定,能表达OECs标记物P75,又经Western Blot对OECs进行了进一步鉴定显示：GFAP和P75均有表达。2. OM-MSCs在低氧微环境下增殖及凋亡检测结果显示：3%O2组比21%02组的增值系数(PI)大,且两组间的细胞存活及凋亡比例无显著差异；3%02组OM-MSCs核染色明显比其他两组比例要高,且21%O2组的细胞核数量最少；Western blot检测显示3%02组的PCNA蛋白表达显著增高,同样21%O2组的表达最少。3. OM-MSCs在低氧微环境下用OECs上清液诱导分化检测结果显示：低氧B组OM-MSCs经OECs诱导后免疫荧光βⅢ-tubulin表达最多,且表达TH神经元(多巴胺能神经元)；Q-PCR显示低氧B组HIF-1α及下游靶基因TH表达明显增高(P0.05); Western blot表明B组中β III-tubulin和TH蛋白表达显著增多,而GFAP蛋白表达明显降低(P0.05)；另外,诱导分化后的神经元经膜片钳检测发现钾离子电流,且ELISA检测结果显示低氧B组中分泌的多巴胺浓度显著增加(P0.05)。结论：低氧微环境能促进OM-MSCs的增殖且对其细胞活性无影响；低氧微环境下培养的OM-MSCs经OECs上清液诱导后能显著提高其向神经元分化的比例及向多巴胺能神经元分化的比例,明显降低了向胶质细胞分化的能力,且低氧微环境下分化的细胞能分泌更高浓度的多巴胺,此过程与OM-MSCs内HIF-1信号通路被激活有关。
【关键词】：低氧微环境 嗅黏膜间充质干细胞 嗅鞘细胞 低氧诱导因子 多巴胺能神经元
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.5
【目录】：

• 中文摘要3-6
• 英文摘要6-12
• 前言12-14
• 第一章 材料14-17
• 1 实验室所需的嗅黏膜来源和实验操作的地点14
• 2 主要试剂14-15
• 3 主要实验仪器15
• 4 培养液和基础试剂的配制15-17
• 4.1 胎牛血清的分装15-16
• 4.2 DMEM/F12培养基的配制16
• 4.3 常规的OM-MSCs培养液配制16
• 4.4 无菌PBS平衡盐溶液配制16
• 4.5 0.25%胰蛋白酶的配制16-17
• 第二章 方法17-27
• 1 OM-MSCs及OECs的取材和培养17
• 2 OM-MSCs的传代17-18
• 3 细胞的冻存于复苏18
• 4 OM-MSCs流式细胞术检测细胞表面标记、细胞周期及凋亡18-19
• 5 低氧微环境下OECs上清液诱导OM-MSCs的方法及实验分组19
• 6 细胞免疫荧光19
• 7 采用免疫荧光PCR检测各实验组的目的基因表达情况19-22
• 7.1 提取组织总RNA19-21
• 7.2 RNA反转录21
• 7.3 Q-qPCR21-22
• 8 用Western-blot分别检测各实验组的蛋白表达情况22-24
• 8.1 样品制备22
• 8.2 蛋白浓度检测22-23
• 8.3 western blot23-24
• 9 用膜片钳检测分化后神经元离子通道开放情况24-25
• 10 酶联免疫吸附实验操作步骤25-26
• 11 统计学处理26-27
• 第三章 结果27-37
• 1 OM-MSCs细胞表面标记物流式鉴定分析27
• 2 OM-MSCs、OECs的免疫荧光、Western blot鉴定27-28
• 3 低氧微环境促进OM-MSCs增殖及凋亡的结果28-31
• 4 诱导OM-MSCs分化后神经元光学显微镜下结果31
• 5 诱导OM-MSCs分化后神经元免疫荧光染色结果31-32
• 6 低氧微环境对神经元及胶质细胞标记物表达的影响32-33
• 7 低氧微环境对HIF-1α及其下游靶基因TH表达的影响33-35
• 7.1 扩增曲线33-34
• 7.2 熔解曲线34-35
• 7.3 Q-PCR相对表达量如下35
• 8 低氧微环境下诱导OM-MSCs分化的神经元电生理特性检测35-36
• 9 ELISA检测诱导分化后各组细胞分泌多巴胺浓度的差异36-37
• 第四章 讨论37-41
• 1 帕金森疾病是目前神经科学领域的难题之一37
• 2 OM-MSCs的生物学特性37-38
• 3 低氧微环境促进OM-MSCs增殖与分化及其相关的研究结果38-39
• 4 MAPK介导HIF-1信号通路在促进MSCs增殖、分化中的作用39-41
• 结论41-42
• 参考文献42-46
• 综述46-54
• 参考文献50-54
• 主要缩写词表54-55
• 在读期间发表的主要学术论文及参与课题55-56
• 致谢56-57

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本文编号：1002245