在癫痫神经元中miR-132调控BDNF-TrkB信号通路表达的研究

发布时间：2017-10-20 01:38

  本文关键词：在癫痫神经元中miR-132调控BDNF-TrkB信号通路表达的研究

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【摘要】：目的:颞叶癫痫是最常见的癫痫类型,且绝大多数是药物难治性癫痫,其发病机制尚不十分清楚。脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)促进了神经元的存活、生长发育及分化等过程。其生物学功能主要通过特异性受体酪氨酸激酶B(tyrosine kinase receptor B,Trk B)介导而实现。近来研究表明BDNF-Trk B信号通路在癫痫的发生与发展过程中起着关键作用。微小RNA(micro RNA)是一种内源性非编码蛋白的小分子RNA。现已被证实其在多种神经系统疾病中发挥着重要功能。研究发现mi R-132在癫痫发病过程中发挥了重要作用,但具体机制有待研究。本课题旨在通过检测转染mi R-132后的海马神经元癫痫模型中Trk B蛋白磷酸化水平的变化,来了解其对BDNF-Trk B信号通路的调控作用,并探讨其在癫痫发病中的作用。方法:制备mi R-132慢病毒表达载体。采用24小时内新生Sprague Dawley(SD)大鼠,取海马神经元体外原代培养7天。采用完全随机化方法将细胞分为①正常组、②癫痫组、③正常+BDNF组、④癫痫+BDNF组、⑤正常+mi R-132组、⑥癫痫+mi R-132组、⑦正常+BDNF+mi R-132组、⑧癫痫+BDNF+mi R-132组。利用膜片钳技术检测海马神经元放电情况,荧光定量PCR法检测海马神经元中mi R-132的表达情况,利用免疫印迹技术检测海马神经元中Trk B和p-Trk B蛋白的表达情况,Quantity one软件对Trk B及p-Trk B的灰度值进行分析,p-Trk B与Trk B的比值表示BDNF-Trk B通路的激活状态。方差分析进行统计学分析,检验水准a=0.05,数据使用SPSS19.0统计软件包进行分析,p≤0.05为有统计学意义。癫痫模型的制备方法是:细胞培养至第7d时,用“无镁”细胞外液处理3h,建立大鼠海马神经元癫痫模型。转染mi R-132组的处理方法是:培养至第7d时加入mi R-132慢病毒稀释液,24h后换成完全培养液继续培养24小时。加入BDNF组的处理方法是:于提取蛋白前10min在培养液中加入BDNF。结果:1、膜片钳技术检测海马神经元痫样放电:与正常组相比,体外培养7d后的癫痫模型组大鼠海马神经元自发性放电频率明显增加(p=0.001)。2、荧光定量PCR法检测mi R-132表达示:与正常组相比,癫痫组mi R-132表达明显增加,差异有统计学意义(p0.001)。3、蛋白免疫印迹结果显示:⑴与癫痫组相比,正常组p-Trk B/Trk B值较高,差异有统计学意义(p=0.008);⑵与正常组和相比,正常+BDNF组p-Trk B/Trk B值升高,差异有统计学意义(p=0.015);⑶与癫痫组相比,癫痫+BDNF组p-Trk B/Trk B值升高,差异有统计学意义(p=0.012);⑷与癫痫+mi R-132组相比,癫痫组p-Trk B/Trk B值较高(p=0.004),癫痫+BDNF+mi R-132组p-Trk B/Trk B值较高(p=0.030)。4、结果提示:加入外源性BDNF后,正常组和癫痫组的p-Trk B/Trk B值均明显升高。说明外源性BDNF可以激活BDNF/Trk B通路,而加入mi R-132后,癫痫组和癫痫+BDNF组的p-Trk B/Trk B值均有所降低结论:1.癫痫状态下,海马神经元mi R-132表达增高。2.加入外源性BDNF后,正常组和癫痫组的p-Trk B/Trk B值均明显升高。说明外源性BDNF可以激活BDNF/Trk B通路。3.正常组比癫痫组的p-Trk B/Trk B值高,说明BDNF-TrkB信号通路在癫痫状态下处于受抑制状态。4.癫痫神经元转染mi R-132后,p-Trk B/Trk B值均有所下降,说明海马神经元转染mi R-132后,抑制了BDNF-Trk B信号通路。
【关键词】：癫痫 海马 脑源性神经营养因子 酪氨酸激酶B 微小RNA-132 免疫蛋白印迹
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.1
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-14
• 研究现状、成果11-13
• 研究目的、方法13-14
• 1 对象和方法14-30
• 1.1 研究对象14
• 1.2 主要试剂及设备14-18
• 1.2.1 实验试剂14-15
• 1.2.2 实验设备15-16
• 1.2.3 主要溶液及试剂配方16-18
• 1.3 实验方法18-29
• 1.3.1 海马神经元原代培养18
• 1.3.2 海马神经元癫痫模型的建立18-19
• 1.3.3 构建miR-132慢病毒表达载体19-25
• 1.3.4 实验分组25
• 1.3.5 荧光定量PCR法检测正常组及癫痫组中mi R-132的表达25-26
• 1.3.6 总蛋白的提取及总蛋白浓度测定26-27
• 1.3.7 免疫印迹法检测蛋白27-29
• 1.4 统计学分析29-30
• 2 结果30-36
• 2.1 正常组及癫痫组miR-132表达情况30-31
• 2.2 膜片钳技术鉴定细胞痫样放电结果31-32
• 2.3 建立miR-132慢病毒表达载体结果32-33
• 2.4 Westem Blot实验结果33-36
• 讨论36-39
• 结论39-40
• 参考文献40-45
• 发表论文和参加科研情况说明45-46
• 综述 MicroRNA在癫痫疾病中的调控作用46-54
• 综述参考文献50-54
• 致谢54

【共引文献】

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本文编号：1064552