MLIF在脑缺血中的神经保护作用及其机制研究

发布时间：2017-10-22 14:29

  本文关键词：MLIF在脑缺血中的神经保护作用及其机制研究

  更多相关文章： 氧糖剥夺 神经保护 单核细胞迁移抑制因子(MLIF) 真核细胞翻译延长因子(eEF1A2) 凋亡

【摘要】：研究目的:脑卒中,主要由缺血性脑卒中和出血性脑卒中组成,其中87%的脑卒中患者为缺血性脑卒中。脑卒中一直以其高致残率和高死亡率严重威胁着世界人民的健康。大量研究表明脑卒中发病机制错综复杂,涉及炎症、凋亡、细胞毒性、氧化应激等多种环节,其中脑缺血引起的炎症反应和神经细胞的凋亡和坏死是引起脑卒中患者脑细胞死亡,进而导致脑组织病变的重要机制。因此,寻找具有抗炎和抗神经细胞凋亡的防治药物具有深远的科学价值和重要的社会意义。单核细胞迁移抑制因子(monocyte locomotion inhibitory factor;MLIF),是一种具有热稳定性的五肽。本课题组在前期的研究中发现MLIF可以显著降低大鼠、小鼠脑缺血模型的脑梗死面积,并发现MLIF可以与脑微血管内皮细胞(b End3细胞)中真核翻译延长因子1A1(eukaryotic translation elongation factor 1 A1,e EF1A1)结合,作用于e NOS的3’-UTR来上调e NOS蛋白的表达,进而降低粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表达水平,发挥对脑缺血的保护作用。为进一步探讨MLIF的脑缺血保护作用机制,本课题拟进一步在神经细胞和整体动物水平研究MLIF的神经保护作用及其机制,为脑卒中的预防和治疗提供新的研究思路。研究方法与结果:1.我们分别运用氧糖剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)和缺氧缺糖复氧(OGD/R)的方法建立人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y体外缺氧/复氧模型,分别采用MTT实验,LDH实验,流式细胞术和Hoechst 33258染色方法检测MLIF对氧糖剥夺后SH-SY5Y细胞的生存率和凋亡率的影响。结果显示我们建立的OGD模型成功诱导了细胞的损伤,并确定缺氧6h为较佳缺氧时间;MTT实验结果显示MLIF可以显著升高OGD以及OGD/R后细胞的生存率(P0.01);LDH实验结果显示,MLIF可以显著改善OGD诱导的神经损伤(P0.01);流式细胞术和Hoechst33258染色实验结果显示,MLIF可以显著改善由于OGD以及OGD/R引起的细胞的凋亡和坏死(P0.01)。2.我们运用western blot实验检测MLIF对OGD后SH-SY5Y细胞内凋亡相关蛋白表达的影响。我们发现在OGD后的SH-SY5Y细胞内,p-JNK、p-p38、p-ERK、p53、cleaved caspase3、cleaved caspase9凋亡相关蛋白的表达显著升高(P0.01 or P0.05),给予MLIF处理后,相比于模型组,p-JNK、p53、cleaved caspase3和cleaved caspase9蛋白的表达显著降低(P0.01 or P0.05),p-p38和p-ERK的表达未发生显著变化。以上结果表明,MLIF可以通过抑制p-JNK/p53凋亡通路来抑制OGD诱导的神经细胞凋亡。3.利用pull-down实验寻找MLIF在大鼠原代神经元细胞和SH-SY5Y细胞内的结合蛋白。通过蛋白之间的pull-down实验,及SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色,发现MLIF的结合蛋白分子量约为50KDa,取特异性蛋白条带进行酶解结合质谱鉴定找出MLIF在细胞中的特异性结合蛋白,比对数据库中肽段匹配数并对比分子量,确定50KDa的蛋白e EF1A2(eukaryotic translation elongation factor 1A2)为MLIF在神经细胞内的结合蛋白。我们运用western blot的方法在原代神经元细胞和SH-SY5Y细胞上做了进一步验证。为了进一步验证MLIF与该靶点蛋白在神经细胞内的结合,我们运用免疫荧光技术采用激光共聚焦显微镜观察,发现FITC-MLIF与e EF1A2在SH-SY5Y细胞的胞浆内存在共定位。以上结果表明MLIF在神经细胞中特异性结合的蛋白为e EF1A2。4.利用siRNA技术,在SH-SY5Y细胞中转染e EF1A2 siRNA,检测MLIF对OGD诱导细胞损伤的保护作用。MTT实验结果显示,相对于NC阴性对照组,e EF1A2基因干扰组细胞生存率显著降低(P0.01);流式细胞术和Hoechst 33258染色检测细胞的凋亡,结果显示相比于NC阴性对照组细胞凋亡率,e EF1A2基因干扰组细胞凋亡率显著升高,细胞核固缩严重,凋亡细胞数显著增加(P0.01)。Western blot结果显示,e EF1A2基因干扰后MLIF抑制凋亡蛋白p-JNK/p53的作用减弱(P0.05)。5.利用大脑中动脉阻断(middle cerebral artery occlusion,MCAO)法制作大鼠脑缺血再灌注模型,研究MLIF对于脑缺血动物模型的神经保护作用及其机制。实验分为假手术组、模型组和MLIF组,尼氏染色检测手术后7天,14天和28天大脑皮层和海马神经元细胞形态,用相应的检测试剂盒检测手术后7周动物血清内氧化应激指标SOD和MDA以及炎症因子IL-1β和TNF-α的变化,Morris水迷宫实验检测各组动物的空间学习记忆能力的变化;结果显示,MLIF可以改善大鼠脑缺血后大脑皮层和海马区神经元形态,并提高动物的记忆能力,升高SOD的含量,降低MDA和炎症因子IL-1β、TNF-α的含量。结论:1.MLIF可以显著提高氧糖剥夺后SH-SY5Y细胞的生存率,抑制氧糖剥夺诱导的细胞凋亡和坏死。2.MLIF在SH-SY5Y细胞中与e EF1A2相结合,抑制p-JNK/p53信号转导通路从而减少OGD诱导的细胞凋亡。3.MLIF可以通过减少大鼠缺血再灌注恢复期大脑皮层和海马神经元损伤,并改善脑缺血再灌注导致的记忆损伤,升高SOD含量清除氧自由基,降低MDA含量抗脂质过氧化,降低炎症因子IL-1β、TNF-α水平来发挥神经保护作用。
【关键词】：氧糖剥夺 神经保护 单核细胞迁移抑制因子(MLIF) 真核细胞翻译延长因子(eEF1A2) 凋亡
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743
【目录】：

• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 缩略词表13-15
• 前言15-18
• 第一部分 MLIF对神经细胞氧糖剥夺损伤的作用研究18-29
• 一、实验材料与方法18-21
• （一）实验材料18-19
• （二）实验方法19-21
• 二、实验结果21-27
• （一）MLIF提高OGD诱导的SH-SY5Y细胞的细胞生存率21-23
• （二）MLIF 降低 OGD 诱导 SH-SY5Y 细胞的细胞凋亡23-26
• （三）MLIF增加OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞的细胞生存率并抑制细胞凋亡26-27
• 三、讨论27-29
• 第二部分 MLIF的抗OGD诱导的神经细胞凋亡作用机制研究29-59
• 一、实验材料和方法29-42
• （一）实验材料29-32
• （二）实验方法32-42
• 二、实验结果42-54
• （一） MLIF对OGD诱导的SH-SY5Y细胞内caspase相关凋亡蛋白表达水平的影响42-43
• （二） MLIF对OGD诱导的SH-SY5Y细胞内p-JNK蛋白表达水平的影响43-44
• （三） MLIF对OGD诱导的SH-SY5Y细胞内p38和ERK蛋白表达水平的影响44-45
• （四）MLIF对OGD诱导的SH-SY5Y细胞内p53蛋白表达的影响45-46
• （五）神经细胞中MLIF特异性结合蛋白46-50
• （六）eEF1A2 RNA干扰对MLIF的神经保护作用的影响50-54
• 三、讨论54-59
• 第三部分 MLIF对于大鼠脑缺血后的神经保护作用研究59-69
• 一、实验材料与方法59-62
• （一）实验材料59-60
• （二）实验方法60-62
• 二、实验结果62-67
• （一）MLIF对脑缺血后大鼠神经元的影响62-65
• （二）MLIF对脑缺血后大鼠记忆能力的影响65
• （三）MLIF对脑缺血后大鼠血清中SOD和MDA的影响65-66
• （四） MLIF对缺血后大鼠血清内炎症因子IL-1β 和TNF-α 的影响66-67
• 三、讨论67-69
• 结论69-70
• 参考文献70-77
• 综述 eEF1A2的非经典作用研究进展77-83
• 1. eEF1A2结构与经典作用77-78
• 2. eEF1A2与肿瘤78
• 3. eEF1A2与凋亡78-79
• 4. eEF1A2与神经系统79-80
• 5. 总结80
• 参考文献80-83
• 在读期间发表论文和科研工作情况说明83-84
• 致谢84-85

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本文编号：1078805