血清饥饿下神经胶质瘤细胞对TRAIL耐受性变化的效应研究

发布时间：2017-10-26 15:02

  本文关键词：血清饥饿下神经胶质瘤细胞对TRAIL耐受性变化的效应研究

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【摘要】：本文对血清饥饿下神经胶质瘤细胞对TRAIL耐受性改变的效应进行了初步研究，实验中选取的神经胶质瘤细胞U251和神经胶质母瘤细胞U87，前者在正常培养下对TRAIL敏感，后者则不敏感。但是经过血清饥饿处理后，U251细胞的敏感性降低，而U87细胞的敏感性增加。为了研究其变化的机制，我们检测了两种细胞在正常培养、单纯TRAIL处理、血清饥饿、血清饥饿与TRAIL联合作用下的TRAIL受体在转录水平、蛋白水平和启动子活性的变化。结果表明：U251细胞株在正常培养下只高表达死亡受体DR5，这解释了U251细胞对TRAIL非常敏感的原因，但经过血清饥饿后，死亡受体DR5在表达水平下降，这初步解释了U251细胞经血清饥饿后对TRAIL耐受性增加的原因；而对于U87细胞，在高表达死亡受体DR5的同时，其假受体DcR2的表达也具有较高的表达水平，由此推测假受体DcR2的高表达是U87细胞对TRAIL不敏感的重要原因，同时经过血清饥饿后，假受体DcR2在转录水平和表达水平都有了显著性的降低，，通过对其启动子活性的测定，我们也进一步证实了其DcR2水平的降低很可能是外界刺激导致的启动子活性降低，从而减少了mRNA的转录，进而使蛋白表达下降，最终导致经血清饥饿后的U87细胞对TRAIL的敏感性大大增加。除了对TRAIL受体变化的关注，我们还检测了血清饥饿后凋亡相关蛋白的变化，并发现p53野生型的U87细胞在饥饿与TRAIL联合处理下Bid切割不明显而促凋亡蛋白Bax有明显的升高，p53突变型的U251细胞Bid切割明显且在饥饿后有所上升，这可能提示了两种细胞内源凋亡途径激活的机制可能不尽相同。
【关键词】：神经胶质瘤 血清饥饿 TRAIL死亡受体 假受体
【学位授予单位】：北京理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.4
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-7
• 目录7-10
• 第一章 绪论10-20
• 1.1 本论文研究的目的和意义10
• 1.2 神经胶质瘤概述10-13
• 1.2.1 神经胶质瘤的遗传学基础11-12
• 1.2.2 神经胶质瘤的生物学基础12-13
• 1.3 神经胶质瘤的治疗策略13-15
• 1.3.1 传统的肿瘤治疗方式13
• 1.3.2 肿瘤的生物治疗13-14
• 1.3.3 肿瘤的抗血管生成治疗14-15
• 1.4 细胞凋亡途径及凋亡相关蛋白15-17
• 1.4.1 细胞凋亡15
• 1.4.2 细胞凋亡的途径15-16
• 1.4.3 肿瘤与细胞凋亡16
• 1.4.4 促凋亡蛋白与凋亡抑制蛋白分析16-17
• 1.5 TRAIL 及其受体诱导凋亡的机制17-18
• 1.5.1 TRAIL 及其受体17
• 1.5.2 DR5 介导的细胞凋亡通路17-18
• 1.5.3 TRAIL 假受体在拮抗凋亡中的作用18
• 1.6 血清饥饿对细胞造成的生物学效应18-19
• 1.7 课题思路与技术路线19-20
• 第二章 材料与方法20-31
• 2.1 细胞培养与饥饿处理20
• 2.2 细胞增殖检测（MTS）20
• 2.4 RNA 提取与逆转录20-22
• 2.5 DNA 聚合酶链式反应（PCR）22-24
• 2.5.1 PCR 扩增模板获得22-23
• 2.5.2 实时荧光定量 PCR23-24
• 2.6 重组质粒的构建24-26
• 2.6.1 DcR1 和 DcR2 启动子段的获得24
• 2.6.2 限制性酶切24
• 2.6.3 酶切产物纯化回收24-25
• 2.6.4 连接与转化25
• 2.6.5 质粒的小量提取与酶切鉴定25-26
• 2.6.6 测序26
• 2.7 免疫印迹（Western-blot）26-29
• 2.7.1 蛋白制备26-27
• 2.7.2 SDS-PAGE27-28
• 2.7.3 转膜28
• 2.7.4 显影28
• 2.7.5 二次免疫印迹28-29
• 2.8 流式细胞术测定细胞膜表面受体蛋白29
• 2.9 细胞转染29
• 2.10 启动子双荧光素酶检测29-30
• 2.11 统计学分析30-31
• 第三章 实验结果31-45
• 3.1 血清饥饿下神经胶质瘤细胞对 TRAIL 耐受性的变化31-33
• 3.1.1 TRAIL 对神经胶质瘤细胞半数致死浓度的确定31-32
• 3.1.2 血清饥饿时间的选择32
• 3.1.3 血清饥饿后神经胶质瘤细胞对 TRAIL 耐受性的变化32-33
• 3.2 TRAIL 相关受体在不同处理下的变化33-39
• 3.2.1 不同处理下细胞内 DR4、DR5、DcR1、DcR2 在 mRNA 水平的变化33-36
• 3.2.2 不同处理下 DR5、DcR1 和 DcR2 受体在蛋白水平的变化36-39
• 3.3 启动子的构建及对外界刺激的应答39-43
• 3.3.1 启动子的构建39-42
• 3.3.2 细胞转染效率的测定42
• 3.3.3 启动子对外界刺激的应答42-43
• 3.4 不同处理下抑凋亡蛋白与促凋亡蛋白水平的变化43-45
• 第四章 讨论45-47
• 4.1 TRAIL 用于肿瘤治疗的可能性和广谱性45
• 4.2 缺血状态下 TRAIL 使用的选择性讨论45-46
• 4.3 血清饥饿模型的问题及肿瘤治疗以外的启示46-47
• 结论47-48
• 参考文献48-53
• 附录53-56
• 攻读学位期间发表论文与研究成果清单56-57
• 致谢57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 方福德;肿瘤饥饿疗法(starving tumor therapy)[J];癌症进展;2004年05期

2 Fiona C. KIMBERLEY,Gavin R. SCREATON;Following a TRAIL: Update on a ligand and its five receptors[J];Cell Research;2004年05期

3 王茂明;杨福兵;;脑胶质瘤的治疗现状[J];医学综述;2012年21期

本文编号：1099176