GM-CSF对替莫唑胺抗高级别胶质瘤细胞的作用
本文关键词：GM-CSF对替莫唑胺抗高级别胶质瘤细胞的作用
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【摘要】：研究背景高级别胶质瘤是成人最常见的原发性脑恶性肿瘤,占脑肿瘤的60-70%,目前的标准治疗为最大化手术切除肿瘤后行放化疗,替莫唑胺是目前被广泛接受治疗脑胶质瘤的化疗药物,主要通过DNA鸟嘌呤的O6和N2位点上的烷基化(甲基化)发挥细胞毒作用,肿瘤耐药现象仍是目前治疗高级别胶质瘤的难题之一。与此同时,与放化疗相关的血液系统毒副作用已引起重视,主要表现为骨髓增生异常综合征、白血病以及严重骨髓抑制,粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)是造血生长因子家族的成员之一,常被用来治疗恶性肿瘤患者化疗所致的的白细胞的数量和/或功能减退,然而应用GM-CSF对脑胶质瘤患者化疗的影响如何仍不可知。研究目的拟应用GM-CSF对高级别胶质瘤细胞进行干预,从而研究TMZ对GM-CSF干预后的高级别胶质瘤细胞的杀伤性并探索其可能的机制。材料与方法1.高级别胶质瘤患者资料收集2013年9至2015年8月收集在河南省人民医院神经外科三病区接受手术治疗的原发性高级别脑胶质瘤患者41例,肿瘤组织均行常规病理检查、免疫组化检测MGMT表达、MGMT启动子甲基化并进行胶质瘤细胞的培养,患者及家属均签署知情同意书。2.高级别胶质瘤细胞的选取和gm-csfr的检测根据病理结果、mgmt表达水平、基因启动子甲基化状态以及细胞培养结果,选6例高级别胶质瘤细胞进行实验,细胞融合度达90%时进行传代,传至第3-4代细胞稳定后采用免疫荧光法检测gm-csfr在细胞中的表达。3.时间-细胞存活率分析设置tmz组、tmz+gm-csf组和调零组(培养基、mtt、二甲基亚砜),gm-csf和tmz终浓度分别为50ng/ml和100μmol/l。培养24h、48h、72h、96h后分别检测细胞的存活率,筛选出最佳的培养时间。4.mtt法检测细胞活性设置对照组、tmz组、gm-csf组、tmz+gm-csf组、调零组(培养基、mtt、二甲基亚砜),先加入gm-csf进行干预,12h后加入tmz使其终浓度分别为50ng/ml和100μmol/l,72h后检测各组的细胞存活率。5.流式检测细胞周期设置对照组、gm-csf组,细胞传代6h后加入gm-csf使其终浓度为50ng/ml,48h后收集细胞,流式细胞仪检测细胞周期。6.流式检测细胞凋亡率设置对照组、gm-csf组、tmz组、gm-csf联合tmz组,加入gm-csf12h后添加tmz,72h后收集细胞用凋亡试剂盒处理上机检测。结果1.高级别胶质瘤细胞的培养选取选取的6例细胞中间变性星形细胞瘤2例,多形性胶质母细胞瘤4例;mgmt蛋白表达阴性3例,阳性表达1例,强阳性表达1例,弱阳性表达1例;mgmt基因启动子甲基化的3例,非甲基化的3例。免疫荧光显示胶质瘤细胞均有gm-csfrα的表达。2.时间-细胞存活率tmz组、gm-csf+tmz组均在培养约72小时后显示出较低的细胞存活率,对胶质瘤细胞的抑制率达到最高。3.mtt法细胞存活率检测6例细胞gm-csf组的细胞存活率与对照组相比均有不同程度的增加,tmz组与gm-csf+tmz组的细胞存活率均比对照组明显下降。mgmt基因启动子甲基化的3例细胞,gm-csf+tmz组的细胞存活率(67.67±1.16,68.13±1.06,68.42±1.73)比tmz组(90.00±1.73,82.33±1.53,82.67±2.11)显著降低(p=0.000,p=0.000,p=0.001),mgmt启动子非甲基化的3例细胞GM-CSF+TMZ组与TMZ组存活率均无显著差异(P0.05)。4.流式细胞周期结果分析6例细胞GM-CSF组(35.32±1.69,26.47±4.74,57.33±2.79,33.78±3.42,34.10±2.90,19.41±1.61)的G1期细胞比例(%)均比对照组(89.91±4.08,71.24±6.91,81.15±4.07,85.53±1.39,64.42±5.23,66.06±5.97)降低,具有统计学差异(P0.05);而S期细胞比例(%)GM-CSF组(55.87±4.07,46.91±4.99,35.28±3.34,35.73±6.05,56.79±2.76,50.78±1.51)较对照组(2.19±2.26,22.08±2.07,19.13±3.25,14.51±1.38,28.97±3.51,26.51±4.64)显著增加(P0.05)。5.流式细胞凋亡结果分析GM-CSF组与对照组相比,6例细胞的GM-CSF组细胞凋亡率均降低;MGMT启动子甲基化的3例细胞GM-CSF+TMZ组凋亡率(19.91±1.93,25.33±2.57,32.15±2.85)与单药TMZ组凋亡率(10.79±0.60,15.15±1.74,22.27±1.89)相比均显著增加,其差异具有统计学意义(P=0.000,P=0.000,P=0.007);MGMT启动子非甲基化的3例细胞GM-CSF+TMZ组与单药TMZ组细胞凋亡率无明显差异(P0.05)。结论1.TMZ对GM-CSF干预后的高级别胶质瘤细胞抑制率随时间变化逐渐增高。2.GM-CSF可增强TMZ对MGMT基因启动子甲基化的高级别胶质瘤细胞的杀伤作用,而对MGMT基因启动子非甲基化高级别胶质瘤细胞的效果不明显。3.GM-CSF可诱导高级别胶质瘤细胞的细胞周期由G1期快速进入S期,从而提高TMZ对高级别胶质瘤细胞的杀伤性。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41
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本文编号：1142019
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