NTR1激动剂PD149163对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用及其机制

发布时间：2017-11-21 07:16

  本文关键词：NTR1激动剂PD149163对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用及其机制

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【摘要】：脑卒中是一种急性脑血管疾病,是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病,具有高发病率、致残率与死亡率的特点,其中缺血性脑卒中的发病率明显高于出血性脑卒中,是全球范围内导致残疾和死亡的主要原因。组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator, tPA)是唯一获得批准的临床治疗急性缺血性脑卒中的药物,但由于它具有治疗时间窗窄、不良反应严重、疗效有限的缺点,大大限制了其在临床中的使用。脑缺血损伤所涉及的病理生理机制十分复杂,随着对缺血级联反应和脑缺血发病机制相关通路的研究,越来越多的人认为作用于单一机制的药物或治疗方法不能影响整个级联反应而达到治疗缺血性脑卒中的效果。因此,寻找新的靶点来研发新的缺血性脑卒中的治疗方法或药物迫在眉睫。近期研究发现,低温治疗可以通过干预缺血损伤后多个病理生理过程而达到脑保护的效果,并且影响了多个与细胞死亡相关的通路,如神经兴奋性毒性、凋亡和自由基损伤、血脑屏障等相关通路,是潜在的缺血性脑卒中的治疗方法。低温治疗除了使用物理降温的手段,还可以使用以中枢温度感受器为靶点的药物,PD149163是一种可以作用于中枢温度感受器的化合物,同时它也是选择性神经降压素受体1的激动剂。PD149163可以透过血脑屏障,外周给药后可以产生一系列中枢神经系统作用,如促进认知作用、抗精神病作用、抗焦虑作用以及减少食物摄入量作用等,它还可以有效地诱导大鼠调节性低温的产生。因此,深入研究和探索PD149163对脑缺血的治疗效果及机制,对于脑缺血的临床治疗具有重要意义。本文研究了PD149163对局灶性脑缺血再灌注大鼠急性期损伤的神经保护作用并初步阐述其作用机制。我们研究发现PD149163能够诱导大鼠体温降低,改善脑缺血再灌注后血神经血管单元功能、抑制细胞凋亡,其神经保护作用可能与阻滞JNK和AMPK/mTOR信号通路进而抑制自噬有关。目的：研究NTR1激动剂PD149163对局灶性脑缺血再灌注大鼠急性期神经损伤的保护作用及机制。方法：1.应用2月龄以上雄性SD大鼠,采用线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型,于复灌后1.5 h、4.5 h腹腔注射给予PD149163 (0.5mg/kg),复灌72 h处死动物收集标本。通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazolium chloride, TTC)染色计算脑梗死体积以及神经运动功能评分观察PD149163对脑缺血再灌注急性期损伤的保护作用。2.通过缺血后0h、4h、7h和10h腹腔注射给予PD149163 (0.5mg/kg),观察缺血后900 min内PD149163对大鼠体温的影响。3.应用二维激光散斑成像技术和多普勒激光血流仪实时监测脑缺血再灌注实验中大鼠的局部脑血流变化情况。4.应用免疫组织化学染色法观察不同脑区(损伤侧皮层和纹状体)中神经元和星形胶质细胞形态和数量的改变。5.应用蛋白质免疫印迹(Western blotting)法检测小胶质细胞、血脑屏障组成成分、凋亡和自噬相关蛋白表达量的变化情况,如基质金属蛋白酶9 (matrix metalloproteinases9,MMP-9)及其底物紧密连接蛋白occludin、促凋亡蛋白Bax、抑凋亡蛋白Bcl-2、Caspase 3、自噬相关蛋白LC3、P62及Beclin1、JNK、p-JNK、AMPK、p-AMPK(Thr172)以及mTOR、p-mTOR(Ser 2448)。结果：1.PD149163能够导致大鼠体温下降,减轻局灶性脑缺血再灌注急性期神经血管单元损伤,但不影响脑缺血过程中病灶区内脑血流的变化于缺血后0h、4h、7h和10h腹腔注射给予PD149163 (0.5mg/kg),可使大鼠体温降低2-5℃；使用多普勒激光血流仪筛选造模成功的大鼠,于复灌后1.5h、4.5 h腹腔注射给予PD149163(0.5mg/kg)可显著降低大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型大鼠的脑梗死体积,并改善其神经功能障碍；PD149163能够显著减轻大鼠脑缺血再灌注急性期大鼠患侧皮层与纹状体脑区内神经元的损伤,抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的活化与增殖；PD149163不影响脑缺血过程中病灶区内脑血流的变化。提示PD149163对局灶性脑缺血再灌注大鼠急性期的神经损伤具有保护作用。2.PD149163改善脑缺血再灌注损伤后的血脑屏障损伤PD149163显著降低了缺血半影区MMP-9的表达,并抑制其底物紧密连接蛋白occludin的降解。3.PD149163抑制大鼠脑缺血再灌注损伤所致的细胞凋亡及自噬PD149163使缺血半影区中Caspase-3和Bax的表达量降低,Bcl-2的表达量增多,Bax/Bcl-2比率下降；PD149163显著抑制P62蛋白表达的下降,降低LC3Ⅱ/LC3 I比率、抑制Beclinl蛋白的表达。4.PD149163抑制脑缺血再灌注损伤中的JNK和AMPK/mTOR信号转导PD149163可以降低p-JNK/JNK和p-AMPK (Thr172)/AMPK的比率,并增加p-mTOR (Ser2448)/mTOR的比率,显著抑制JNK和AMPK Thr172的磷酸化、增加mTOR Ser 2448的磷酸化,使得JNK和AMPK的活性下降、mTOR的活性增高。结论：1.PD149163对大鼠局灶性脑缺血再灌注急性期损伤具有神经保护作用,能减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注急性期所致的神经血管单元损伤,但不影响脑缺血再灌过程中病灶区的脑血流。2.PD149163可能通过阻滞JNK和AMPK-mTOR自噬相关信号通路而抑制自噬,对抗脑缺血再灌注急性期所致细胞凋亡。综上所述,本研究工作的主要创新点在于：1.发现PD149163对局灶性脑缺血再灌注大鼠急性期损伤具有神经保护作用。2.初步阐明PD149163通过改善神经血管单元功能、抑制自噬通路以及对抗细胞凋亡而发挥神经保护作用。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743

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