空肠弯曲菌连续灌胃经小鼠消化道定植后分离及分离株毒力变化的研究

发布时间：2017-12-02 17:36

  本文关键词：空肠弯曲菌连续灌胃经小鼠消化道定植后分离及分离株毒力变化的研究

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【摘要】：目的:空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,Cj)经连续多批次小鼠灌胃消化道后,并在消化道定植、分离及排出,得到空肠弯曲菌定植分离株,与贮存空肠弯曲菌相比,其在消化道环境中革兰氏染色形态变化、生长繁殖能力及运动能力等毒力的有所不同,为了研究空肠弯曲菌分离株毒力变化规律;认识不同毒力的空肠弯曲菌分离株致小鼠周围神经病变能力。方法:1复苏及培养库存空肠弯曲菌:从空肠弯曲菌菌株库中选取lulei株作为实验菌株。从-80℃冰箱中取出置于-20℃冰箱中24小时,再由-20℃冰箱至-4℃冰箱中24小时,于室温下溶化,数分钟后,将菌液倒入装有5ml灭菌布氏肉汤培养基的西林瓶中,放置于三气培养箱中,在42℃微需氧(10%CO2、5%O2、85%N2)环境增菌24小时,之后传代至含7%脱纤维羊血的哥伦比亚血平板培养基,于相同环境条件下培养24小时,并以同样方法传代至第3代,成功复苏空肠弯曲菌。2空肠弯曲菌的鉴定:采用革兰氏染色法,马尿酸钠水解试验以及多重PCR的分子方法鉴定空肠弯曲菌。3实验动物的选择和分组方法:选用4周龄,体重为9-12g,雄性清洁级健康昆明小鼠。共分为18个批次,每一批次6只小鼠。4攻毒前对小鼠粪便进行空肠弯曲菌的分离。5攻毒方式和浓度:经口服灌胃小鼠3×108cfu/ml浓度的活菌菌悬液0.5ml,所有小鼠灌喂前均禁食水12小时,灌胃后立即给予食水。6空肠弯曲菌分离培养:将库存空肠弯曲菌lulei株灌胃第一批次小鼠,灌胃1次,于灌胃后24小时和第7天、8天、9天,分时间点采集小鼠粪便,并从粪便中分离纯化上述各个时间点的空肠弯曲菌定植分离株。将分离纯化得到的24小时空肠弯曲菌lulei分离株灌胃第二批次小鼠,以此类推,直至完成18批次空肠弯曲菌的分离培养。7各时间点各批次空肠弯曲菌分离株间生长繁殖能力、运动能力及革兰染色形态变化观察:细菌的生长繁殖能力、运动能力和形态变化是评价细菌毒力的重要指标,分别采用细菌浊度测定法、运动环直径法和革兰染色的方法比较各空肠弯曲菌分离变异株间生长繁殖能力、运动能力及革兰染色形态变化的差异。8用统计软件spss13.0分析各时间点各批次空肠弯曲菌分离株生长繁殖速度及运动环直径数据。9实验动物一般情况的观察:自购买小鼠当日起每天观察小鼠的状态:如进食水情况、精神状态、皮毛光滑程度、体重及肢体活动情况、大便性状、有无腹泻及肢体瘫痪等症状,观察时间为30天,之后处死解剖动物,如动物在30天内出现明显瘫痪症状,及时解剖并取双侧坐骨神经进行神经病理观察。结果:1成功复苏贮存空肠弯曲菌lulei株;2攻毒前昆明雄鼠粪便未分离出空肠弯曲菌;3获得第1批次至第18批次24小时的灌胃空肠弯曲菌分离株;4第1批次至第7批次未分离到7天、8天、9天定植的空肠弯曲菌分离株;5自第8批次开始空肠弯曲菌能够在小鼠消化道内定植;6获得第8批次至第18批次7天、8天、9天的空肠弯曲菌定植分离株;7统计软件spss13.0分析,采用kruskalwalltest、lsd统计方法分析,相同时间点不同批次分离株间单位时间内生长繁殖速度有统计学差异,随着批次的增加空肠弯曲菌生长繁殖能力与贮存空肠弯曲菌相比逐渐增强,不同批次空肠弯曲菌分离株生长繁殖能力相比有统计学差异;经重复测量设计分析不同时间点同一批次空肠弯曲菌定植分离株,单位时间内生长繁殖速度有统计学差异;8经统计软件spss13.0分析,采用kruskalwalltest、lsd统计方法分析,相同时间点不同批次分离株运动能力有统计学差异,各批次相同采集粪便的时间点分离得到的定植变异株,与贮存空肠弯曲菌相比,随着批次的增加空肠弯曲菌分离株运动能力在一定范围内波动变化,不同批次空肠弯曲菌分离株运动能力相比有统计学差异;经重复测量设计分析不同时间点同一批次分离株运动能力相比有统计学差异;9相同时间点不同批次空肠弯曲菌分离株间经革兰氏染色镜检观察,菌体形态发生变化。随着各时间点批次增加,空肠弯曲菌分离株菌体逐渐变细、变长,弯曲杆状或螺旋杆状程度逐渐明显,呈双“s”形或三“s”形;不同时间点同一批次空肠弯曲菌分离变异株间革兰染色镜检观察,形态发生变化,随着时间点的增加,菌体逐渐变细、变长,弯曲杆状或螺旋杆状程度逐渐明显;10小鼠一般情况的观察:在灌胃后30天小鼠被处死时精神状态好,活动能力及进食水情况如常,体重无明显减轻,未出现腹泻及瘫痪等症状。结论:1河北医科大学动物中心清洁级昆明雄鼠粪便内无空肠弯曲菌存在。2空肠弯曲菌灌胃小鼠一次24小时能够分离得到分离株。3空肠弯曲菌灌胃小鼠一次能够在小鼠体内定植。4空肠弯曲菌灌胃小鼠一次7、8、9天后分离定植株,不是每一批次都能分离到。5空肠弯曲菌经过小鼠体内培养分离株形态发生变化,有短小变得细长、弯曲杆状或螺旋杆状更明显。6空肠弯曲菌经过小鼠体内培养分离株生长繁殖速度变快。7空肠弯曲菌经过小鼠体内培养分离株大部分运动能力增强。8空肠弯曲菌灌胃小鼠一次经过小鼠体内培养,30天未能使小鼠出现腹泻、瘫痪等临床症状。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R745

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本文编号：1245747