TAG1信号对胶质瘤干细胞增殖与分化的作用及相关基因调节机制的研究

发布时间：2018-01-20 13:00

本文关键词： TAG-1(瞬变轴突蛋白-1) APP(淀粉样前体蛋白) AICD(淀粉样前体蛋白胞内段) 胶质瘤干细胞细胞行为学　出处：《南方医科大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景胶质瘤(glioma)是最常见的颅内原位实体瘤,约占原发性神经系统肿瘤的29%,占恶性脑肿瘤的80%。其中恶性胶质瘤增殖迅速、侵袭度高、致死率高,已成为中枢神经系统疾病中最难治疗的疾病之一。虽然随着临床手术治疗、放疗、化疗等治疗技术的综合运用,胶质瘤的临床疗效与预后仍然没有明显改善。随着对胶质瘤研究的深入而广泛的开展,胶质瘤干细胞(Glioma stem cells, GSCs)的发现及其理论与研究逐渐受到关注。胶质瘤干细胞是指胶质瘤中的一小部分因具有自我更新、无限增殖和分化成瘤等干性特征的细胞,是胶质瘤的成瘤细胞；胶质瘤干细胞因其干性特征被认为是胶质瘤发生、发展及复发的根源。因此,有关胶质瘤干细胞的行为学及其相关机制的研究,对寻找胶质瘤更为有效的治疗新“靶标”具有重要意义。目前研究认为,一些相关基因、受体、信号分子的异常表达及其相关的信号转导通路可能涉及胶质瘤的发生与发展。细胞微环境中的信号分子及其相关的信号通路也可能导致胶质瘤干细胞增殖、分化等生物学行为的变化。因此,多方面了解胶质瘤干细胞的相关信号变化,发现新的胶质瘤干细胞信号通路并进行深入探索已成为目前胶质瘤干细胞的研究热点。 TAG1(transient axonal glycoprotein-1,瞬变轴突糖蛋白1,也可称为TAX1, Contactin2, CNTN2, Axoninl)是一种细胞表面黏附分子,属于免疫球蛋白家族Contactin/F3亚家族,主要表达在中枢神经系统发育发展过程中。以往研究认为,TAG1的生理功能主要是作为一种细胞粘附分子引导神经细胞的粘附、迁移以及引导神经轴突的生长,但其具体的作用途径或模式目前还不清楚。研究发现TAG1与胶质瘤可能相关,在胶质瘤组织细胞及胶质瘤细胞系细胞中均有检测出TAG1的表达。我们实验室同事的研究则发现TAG1信号可能通过某种细胞信号途径以促进胶质瘤增殖的方式参与了胶质瘤的发生发展。此外,TAG1信号可能通过SHH信号通路对胶质前体细胞起增殖促进及分化抑制的作用。但TAG1在胶质瘤干细胞中的相关作用仍不清楚。 APP (Aβ前体蛋白,Amyloid β precursor protein, APP)是新发现的TAG1的一种受体信号。APP广泛的表达在神经系统中,在神经干细胞中也有明确表达。研究显示,APP作为一种维持细胞与细胞间以及细胞与细胞外间质间的细胞信号,所涉及的生理作用也非常广泛,如细胞的迁移、神经细胞的分化与再生、突触发育、神经保护等。其次,APP通过特异性的水解酶的剪切所产生的APP胞内剪切片段AICD (APP intracellular domain, AICD)可作为APP信号的直接传导分子进入细胞核内参与细胞信号传导。研究发现,APP及AICD均有可能与胶质瘤相关：APP在胶质瘤细胞系细胞中存在有过表达的现象,这种过表达可能涉及到胶质瘤细胞的异常增殖和异常形态；APP也可能导致外源性的神经干细胞或神经前体细胞向胶质细胞方向分化增加。而AICD可能与Notch蛋白的胞内片段NICD相互作用,通过上调NICD及Hesl的表达或直接上调Hesl的表达而促进肿瘤的产生,同时AICD可使神经祖细胞的胶质发生增加。但是APP与AICD在胶质瘤中的具体作用及可能的机制仍不明确。由于TAG1/APP信号最初发现在神经干细胞中,而在普通的胶质瘤细胞中也发现有TAG1及APP信号分子的表达,故本实验选择胶质瘤干细胞为研究对象,研究TAG1/APP信号在胶质瘤干细胞中的表达情况,并对其涉及的可能的作用机制进行探讨,以期为胶质瘤的治疗提供新线索。本研究拟分为三个部分。第一章人胶质瘤细胞系中胶质瘤干细胞的分离、培养和鉴定目的：从人源性U87胶质瘤细胞株中分离培养并扩增U87胶质瘤干细胞,并对其干性特征进行鉴定。为研究胶质瘤干细胞的信号通路奠定基础。材料与方法：采用无血清培养基(DMEM/F12+20ng/mLbFGF+20ng/mLEGF+2%B27),在1%氧浓度培养条件(1%O2,5%CO2,94.5%N2,98%湿度,37℃)下进行U87胶质瘤干细胞的分离及扩增培养。对扩增所获得的肿瘤球细胞进行形态观察；使用干性标记物进行干细胞表面标记的鉴定；使用常规含血清培养基(DMEM/F12+10%FBS)进行肿瘤球细胞的分化诱导,鉴定分化细胞表型以检测肿瘤球细胞的多向分化能力；通过裸鼠皮下成瘤实验鉴定肿瘤球细胞的成瘤性；采用细胞增殖性实验CCK-8(Cell Counting Kit-8)测定并绘制肿瘤球细胞的生长曲线,以了解肿瘤球细胞的增殖特性。结果：人U87胶质瘤细胞系细胞在含血清培养基中呈贴壁生长,胞体有突起,细胞可呈梭形、星形、多角形。经无血清培养基低氧浓度培养,可呈悬浮状态生长,形成悬浮肿瘤克隆球；这些肿瘤球细胞可以被反复消化传代至少1个月以上。使用免疫细胞化学染色检测,所获得的U87肿瘤球细胞可表达干性标记物CD133和Nestin;使用流式细胞仪检测,干性标记物CD133和Nestin阳性率可以达到90%以上。将U87肿瘤球细胞转入含血清培养基中进行诱导分化,可重新分化成贴壁细胞,形态与亲本U87细胞相似,经过神经系统三系细胞(星形胶质细胞、神经元、少突胶质细胞)标记物鉴定,可表达星形胶质细胞(GFAP)、神经元(Ⅲ β-tubulin)、和不成熟少突胶质细胞(01)标记物。将U87肿瘤球细胞进行裸鼠皮下种植,可观察到肿瘤球细胞所形成的皮下移植瘤。通过生长曲线的绘制,与普通U87胶质瘤细胞的生长速度(1天：0.520±0.006,3天：0.690±0.010,5天：0.964±0.014)相比,U87肿瘤球细胞的生长速度(1天：0.855±0.049,3天：1.452±0.139,5天：1.925±0.051)较快,统计学分析显示细胞种类和时间因素存在交互效应(F=37.359,P=0.000)；进行单独效应分析,固定三个时间点两组间存在差异(p0.05)。结论：人U87胶质瘤细胞系中存在有具无限增殖、自我更新及多向分化潜能的胶质瘤干细胞,通过低氧无血清培养基可以对U87胶质瘤细胞中的胶质瘤干细胞进行分离培养及有效扩增。第二章TAG1/APP信号通路在胶质瘤干细胞增殖与分化中的表达目的：研究胶质瘤干细胞增殖与分化培养过程中TAG1/APP信号的表达情况,以分析TAG1/APP信号与脑胶质瘤干细胞增殖和分化的关系。方法：以体外分离培养的第5代以后的U87胶质瘤干细胞作为胶质瘤干细胞模型,使用无血清培养基(DMEM/F12+bFGF20ng/ml、EGF20ng/ml、B270.2%)在常规氧浓度37℃,5%C02培养箱中培养进行增殖培养3天；含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基在常规氧浓度37℃,5%CO2培养箱中诱导分化0、1、5天；分别通过使用qRT-PCR及Western blot方法,检测细胞中TAG1和APP的表达。结果：U87胶质瘤干细胞呈悬浮球样增殖扩增,通过第5代以上的收集球细胞进行TAG1、APP的qRT-PCR基因表达检测和Western blot蛋白表达检测。与普通U87胶质瘤细胞相比较,在U87胶质瘤干细胞增殖时,TAG1的mRNA表达(2.427±0.690)和APP的mRNA表达(1.413±0.146)均呈现增强(t=-3.581,P=0.023及t=-4.913,P=0.039); TAG1和APP的蛋白表达在U87胶质瘤干细胞(TAG1:0.203±0.042, APP:0.643±0.015)中也较普通U87胶质瘤细胞中(TAG1:0.103±0.025, APP:0.497±0.021)均有增强(t=-3.560,P=0.024及t=-9.839,P=0.001)。U87胶质瘤干细胞在含10%胎牛血清的普通培养基中分化时,随着分化的进行,可以观察到TAG1及APP的mRNA在分化第1天(TAG1：1.033±0.087,APP：0.927±0.065)仍然有较高表达,与未分化时TAG1及APP的mRNA表达(均为1)相比较差异不显著；而随着分化出的成熟普通胶质瘤细胞比例增多,TAG1及APP mRNA的表达在第5天出现下降(TAG1：0.527±0.110,APP：0.533±0.098),与分化第1天相比较差异显著(分别是t=6.258,P=0.003和t=5.785,P=0.004)。分化过程中,TAG1与APP蛋白的表达情况与其mRNA情况相一致。与未分化状态相比较(TAG1:0.557±0.021, APP:0.663±0.021),在U87胶质瘤干细胞分化第1天TAG1及APP的蛋白表达(TAG1：0.523±0.032,APP：0.623±0.031)无明显减弱,统计分析差异不显著；而随着分化过程的进展,TAG1及APP的表达减弱(TAG1:0.417±0.015, APP:0.477±0.015),与分化第1天的TAG1及APP的相对表达量相比较出现显著性差异(P=0.002和P=0.000)。结论：TAGl/APP信号在U87胶质瘤干细胞中存在异常高表达；TAG1/APP信号通路的异常可能涉及U87胶质瘤干细胞中增殖的维持及分化的启动。第三章TAG1/APP信号通路对胶质瘤干细胞增殖与分化的调控作用目的：干扰U87胶质瘤干细胞中TAG1的表达,观察下调TAG1信号后脑胶质瘤干细胞增殖和分化行为的变化及对EGFR与Hes1信号的影响,以探讨TAG1/APP/EGFR和TAG1/APP/Hes1信号调控对胶质瘤干细胞的潜在致病机制。方法：根据人CNTN2基因序列,设计构建4个miRNA干扰载体(CNTN2-1、2、3、4),并通过测序进行鉴定；通过对U87胶质瘤干细胞进行瞬时转染后用Western blot进行干扰效率筛选；对干扰效率最好的一组进行进行慢病毒构建包装。按照MOI=100对U87胶质瘤干细胞进行转染,72小时后观察细胞生长状态及绿色荧光的表达。使用CCK-8细胞增殖活性检测及干细胞球数量与大小测定评估RNAi-TAGl对U87胶质瘤干细胞增殖的影响,使用U87胶质瘤干细胞分化后GFAP表达量及U87胶质瘤干细胞移植后成瘤大小评估RNAi-TAG1对U87胶质瘤干细胞分化的影响。使用qRT-PCR及Western blot方法,检测增殖状态下及分化过程中AICD、EGFR、HES1表达的变化。结果：经过Western blot检测发现CNTN2-2所产生的干扰效果最佳,将其成功构建为Lenti-EGFP-CNTN2-miR,并以Lenti-EGFP-NC-miR作为空病毒对照。对TAG1信号进行RNAi后胶质瘤干细胞增殖受到抑制,与Lenti-EGFP-NC-miR空病毒对照组各时间点增殖活力(48小时：0.757±0.012,72小时：1.297±0.018,96小时：1.377±0.044)相比较,Lenti-EGFP-CNTN2-miR干扰组CCK-8各时间点增殖活力(48小时：0.578±0.008,72小时：0.963±0.100,96小时：1.154±0.035)；绘制生长曲线进行析因分析显示细胞种类和时间因素存在交互效应(P=-3.202,P=-0.038),因此着重进行单独效应分析,固定三个时间点两组均有差异(P0.05); RNAi-CNTN2组U87胶质瘤干细胞增殖活力明显降低(P0.05)。对干扰后U87胶质瘤干细胞的体外成球情况进行分析；肿瘤球的数量在RNAi-CNTN2组：24.000±3.606,在Neg Ctrl组：32.667±3.055;多重比较结果显示,与Neg Ctrl组相比较,RNAi-CNTN2组肿瘤球的数量明显减少(P=0.015)。肿瘤球的直径在RNAi-CNTN2组：89.337±10.097,在Neg Ctrl组：124.193±21.759；多重比较结果显示,与Neg Ctrl组相比较,RNAi-CNTN2组肿瘤球的直径明显减小(P=0.008)。对TAGl信号进行RNAi后胶质瘤干细胞的分化也受到抑制,与Lenti-EGFP-NC-miR空病毒对照组相比,Lenti-EGFP-CNTN2-miR干扰组分化第5天时的GFAP表达量均较未转染空白对照组明显降低(RNAi-CNTN2组：0.1647±0.004,Neg Ctrl组：0.5656±0.008；F=1651.841,P=0.000)；20天时裸鼠皮下肿瘤的体积有明显的较小(RNAi-CNTN2组：1638.385±329.656,Neg Ctrl组：2383.348±301.801;F=9.817,P=0.008)。Western blot检测结果显示,RNAi-TAG1转染48小时后胶质瘤干细胞,与空病毒转染对照组相比较,RNAi-CNTN2组U87胶质瘤干细胞中APP表达无明显变化(F=9.719,P=0.131)；AICD的表达则呈现明显减少(RNAi-CNTN2组：0.302±0.007,Neg Ctrl组：0.865±0.056；F=121.417,P=0.006)。在诱导分化后第3天时,Lenti-EGFP-CNTN2-miR组中U87胶质瘤干细胞的GFAP的蛋白表达明显减少(F=1651.841,P=0.000)。通过qRT-PCR检测显示,EGFR和Hes1的基因表达,RNAi-CNTN2组较Neg Ctrl组明显降低(F=26.967,P=0.048,和F=1598.701,p=0.000)。Western blot检测结果显示,EGFR蛋白相对表达量(RNAi-CNTN2组：0.121±0.011,Neg Ctrl组：0.754±0.021),Hesl蛋白的相对表达量(RNAi-CNTN2组：0.133±0.004,Neg Ctrl组：0.418±0.003),与Neg Ctr1组相比较,RNAi-CNTN2组中EGFR和Hes1的蛋白表达明显减少,差异具有显著性(F=765.277,P=0.000和F=3580.478,P=0.000)。结论：RNAi-TAG1信号可能通过TAG1/APP/AICD/Hes1信号及TAG1/APP/AICD/EGFR信号途径对U87胶质瘤干细胞的增殖与分化产生抑制作用,抑制TAG1信号可能为胶质瘤的治疗提供新的线索。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.41

【参考文献】