抗血小板聚集药物联合干细胞治疗缺血再灌注模型的疗效及机制研究

发布时间：2018-01-20 13:20

本文关键词： 脑缺血阿司匹林氯吡格雷骨髓间充质干细胞疗效　出处：《吉林大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:脑梗死(Cerebral infarction,CI)又称缺血性脑卒中,指因脑内局部血液供应不足导致脑组织缺血缺氧,引起局限性坏死或脑软化。目前,在我国已有CI患者700万人,平均发病率为(116-219)/10万人口,年死亡率为(58~142)/10万人口,是致死率最高的疾病之一。CI具有较高的发病率、致残率和病死率,其中不同程度丧失劳动能力者可达75%,是导致致残的最常见疾病,也是导致我国成人残疾的首要原因。近年来,随着我国老龄化进程的加速,CI发病率也逐年上升。CI临床表现十分复杂,疾病的程度主要取决于梗死灶的大小和部位,表现为局灶性的神经功能缺损,如头痛、头晕、恶心、呕吐、运动性和(或)感觉性失语、肢体偏瘫、大小便失禁等。由于CI对患者家庭、社会造成重大的经济和精神负担,已成为严重的公共卫生问题。因此,不断探索合理、有效的CI治疗方法,降低CI的致死率、致残率及复发率,已成为神经病学的重要问题。阿司匹林和氯吡格雷是目前临床上常用的抗血小板聚集药物,大量研究证明使用阿司匹林或氯吡格雷预防CI的复发具有重要意义,而临床上关于阿司匹林联合氯吡格雷治疗颅内动脉粥样硬化性狭窄也有报道,且两种药物的联合使用已逐渐得到神经内科医生的重视。然而,如何选择应用时机、药物计量等问题仍有待研究,且尚未有关于两种药物联合应用治疗大鼠脑缺血再灌注动物模型的实验报道。骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是一类来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞,也是目前研究最多、最具有代表性和分化倾向最多的成体干细胞之一。大量的体外实验证明,在不同诱导条件下,间充质干细胞可以向神经元样细胞分化。目前,BMSCs的分离与提取方法较为成熟,安全性高,且可以通过迁移和增殖对脑组织起到中枢保护和修复作用。综上,鉴于干细胞治疗与抗血小板药物治疗的优越性,本研究从临床应用意义角度出发,选用阿司匹林和氯吡格雷对脑缺血再灌注大鼠模型的治疗疗效进行对比分析;同时,设置联合用药组(阿司匹林联合氯吡格雷用药)观察单独用药与联合用药后对大鼠神经功能、脑组织蛋白表达等方面的影响;此外,首次提出在动物模型中验证干细胞联合两种抗血小板聚集药物治疗脑缺血再灌注大鼠模型的设想,同时比较干细胞治疗与药物治疗对大鼠模型的疗效,为临床实际应用提供实验数据和理论依据。目的:(1)观察、比较抗血小板聚集药物阿司匹林、氯吡格雷及两者联合用药治疗脑缺血再灌注模型的疗效;(2)观察、比较BMSCs治疗与抗血小板聚集药物治疗脑缺血再灌注模型的疗效(3)为CI患者的治疗提出一条新的途径,即干细胞联合抗血小板聚集药物治疗CI患者,并为其临床应用提供真实的实验数据和可靠的理论支持。方法:选择3-4月龄的健康雄性Sprague Dawley大鼠,体重250-300 g,构建大脑中动脉栓塞(Middle cerebral artey occolusion,MCAO)模型,成模后随机将MCAO模型大鼠分为9组(n=13):假手术组(A组)、模型自然恢复组(B组)、阿司匹林治疗组(C组)、氯吡格雷治疗组(D组)、阿司匹林联合氯吡格雷治疗组(E组)、BMSCs治疗组(F组)、BMSCs联合阿司匹林治疗组(G组)、BMSCs联合氯吡格雷治疗组(H组)和BMSCs联合阿司匹林和氯吡格雷治疗组(I组)。其中,B组不做任何干预,C和G组每天给予阿司匹林灌胃(每只10.3mg/kg/d),D和H组每天给予氯吡格雷灌胃(每只7.8 mg/kg/d),E和I组每天给予阿司匹林和氯吡格雷灌胃(每只阿司匹林10.3 mg/kg/d,氯吡格雷7.8mg/kg/d),F、G、H和I组在成模后第7d给予尾静脉注射BMSCs(每只2×106/m L,1m L)。在治疗的第15d,采用Morris水迷宫评价各组大鼠的空间学习记忆能力。实验的第21d进行标本取材,一部分大鼠10%水合氯醛麻醉后心脏取血,断头取海马组织,另一部分大鼠进行心脏灌流,固定脑部准备进行石蜡包埋和组织切片。血清采用ELISA试剂盒检测炎症因子含量差异;切片采用HE染色和尼氏染色观察脑组织大体变化;采用TUNEL染色观察大鼠脑部组织神经元凋亡;采用免疫组织化学染色观察不同神经营养因子表达情况;采用蛋白印迹法(Western Blot)检测凋亡信号通路基因(Bcl-2、Bax、Caspase-3和Surivivin)表达的变化。结果:(1)成功建立MCAO大鼠模型。(2)成功分离、培养BMSCs,并成功进行尾静脉移植。(3)抗血小板聚集药物联合BMSCs治疗对MCAO大鼠学习记忆功能的影响。神经功能评分结果显示:与B组比较,其他治疗组大鼠神经功能得分均增高,且I组最高(p0.05);药物治疗组相比,C组评分最低,E组最高(p0.05);BMSCs治疗组神经功能评分高于药物治疗组(p0.05)。Morris水迷宫结果显示:同一时间点不同治疗组大鼠逃避潜伏期逐渐缩短(p0.05),与B组相比,各治疗组大鼠逃避潜伏期均缩短,且E组逃避潜伏期短于C、D组,BMSCs组短于C、D、E组,其中I组逃避潜伏期最短;不同时间点同一治疗组,随着时间的延长,逃避潜伏期也逐渐缩短(p0.05)。说明,抗血小板聚集药物可有效改善MCAO大鼠学习记忆功能,且联合应用效果更佳,此外I组治疗效果最佳。(4)抗血小板聚集药物联合BMSCs治疗对MCAO大鼠炎性损伤的影响。ELISA结果显示:与B组相比,各治疗组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、HSP-70和ACTH值均降低(p0.05),且单纯用药组、联合用药组、BMSCs移植组和BMSC联合药物治疗组血清中炎性因子浓度逐渐降低,其中I组大鼠血清炎性因子水平最低(p0.05)。说明,抗血小板聚集药物可有效降低MCAO大鼠体内炎症反应,且BMSCs联合药物治疗效果最佳。(5)抗血小板聚集药物联合BMSCs治疗对MCAO大鼠脑部组织病理学的影响。HE染色片结果可以看出B组脑部缺血区脑组织稀疏、神经细胞变形、核固缩或核碎裂,海马CA1、CA4区神经细胞大量坏死,而A组神经细胞正常;C、D治疗组大脑皮质区神经细胞坏死,但少于B组;E治疗组大脑皮层神经细胞坏死数量少于上述各组;BMSCs治疗组细胞坏死数量少于药物治疗组,且联合药物治疗后病变最轻。尼氏染色片结果:A组大鼠脑部组织镜下观察尼氏小体呈蓝色,细胞内尼氏小体多见,而B组尼氏小体罕见,且缺血区神经细胞坏死、数量减少,少数神经细胞尼氏小体也消失、胞核固缩;不同药物治疗组尼氏小体数量有所增加,且E组尼氏小体数量多于C、D组;BMSCs移植治疗组尼氏小体明显增多,且I组数量最多。(6)抗血小板聚集药物联合BMSCs治疗对MCAO大鼠脑部海马神经元凋亡的影响。TUNEL染色结果显示:B组大鼠海马神经元发生明显的变性和死亡,损伤部位主要位于缺血侧大脑皮质、皮质下和海马区域,凋亡率为51.33%,而不同治疗组与B组相比细胞凋亡率明显降低(p0.05);D组细胞凋亡率低于C组(p0.05),而E组细胞凋亡率低于C、D组;BMSCs治疗组细胞凋亡率36.72%低于药物治疗组,且BMSCs治疗组细胞凋亡率逐渐降低,I组细胞凋亡率最低。(7)抗血小板聚集药物联合BMSCs治疗对MCAO大鼠脑神经营养因子分泌的影响。结果显示:神经营养因子GFAP、GDNF和NSE在B组中罕见,随着治疗方式的不同,阳性细胞数量逐渐增多,镜下多见细胞浆出现棕黄色或棕褐色细胞;不同治疗方法相比,联合两种抗血小板聚集药物组阳性细胞数量多于单纯一种药物治疗组,而BMSCs联合药物治疗后,阳性细胞数增多。(8)抗血小板聚集药物联合BMSCs治疗对MCAO大鼠脑组织蛋白含量的影响。Western blot检测结果显示:A组不表达细胞凋亡相关蛋白,与B组相比其他治疗组surivivin表达逐渐增加,而caspase-3表达逐渐减少;其中,联合两种药物治疗组surivivin表达量高于单纯一种药物治疗(p0.05);C与D组相比蛋白表达量无统计学差异(p0.05);BMSCs治疗组surivivin表达量高于药物治疗组,而caspase-3表达量低于药物治疗组(p0.05);BMSCs联合药物治疗组surivivin表达量高于其他组,而I组surivivin表达量最高,caspase-3表达量最低(p0.05)。结论:(1)两种抗血小板聚集药物阿司匹林和氯吡格雷同时应用于治疗大鼠MCAO模型,疗效优于单纯一种药物治疗;(2)BMSCs联合阿司匹林或联合氯吡格雷治疗大鼠MCAO模型,疗效优于单纯给予抗血小板聚集药物治疗;(3)BMSCs联合阿司匹林及氯吡格雷两种药物治疗大鼠MCAO模型,疗效最佳。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R743.3

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