胶质瘤细胞中ADAR2 mRNA前体选择性剪接模式的分析及Bcl-x剪接转换寡核苷酸诱导胶质瘤细胞凋亡的实验研究

发布时间：2018-01-26 05:07

  本文关键词： 胶质瘤 RNA编辑 选择性剪接 RT-PCR 选择性剪接 剪接转换寡核苷酸 凋亡 流式细胞术　出处：《吉林大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分胶质瘤细胞中ADAR2mRNA前体选择性剪接模式的分析 目的：比较胶质瘤细胞U87、U251、A172和正常星形胶质细胞HA1800中ADAR2mRNA前体选择性剪接模式的差别。 方法：RT-PCR产物测序检测胶质瘤细胞和正常胶质细胞中GluR2Q/R位点的A-to-I编辑水平；Real-time PCR方法检测ADAR2mRNA的表达量；RT-PCR及测序比对检测胶质瘤细胞中ADAR2mRNA前体的选择性剪接位点，根据鉴定出的选择性剪接位点设计特异性引物，Real-time PCR方法检测胶质瘤细胞U87、U251、A172和正常星形胶质细胞HA1800中不同剪接转录本的相对表达量，比较胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中ADAR2mRNA前体剪接模式的差异。结果：胶质瘤细胞U87、U251、A172中GluR2Q/R位点的A-to-I编辑水平明显下降（P＜0.01），ADAR2mRNA总的表达量没有显著变化（P＞0.05）。在胶质瘤细胞U87、U251、A172和正常星形胶质细胞HA1800中均检测到ADAR2mRNA前体有3个剪接位点：第1个剪接位点位于外显子-1和外显子1之间，产生Exon1a；第2个剪接位点导致Exon2缺失；第3个剪接位点位于催化活性区域，引起Exon5a的插入。其中第3个位点的剪接水平在胶质瘤细胞和正常胶质细胞中存在差异。Real-time PCR检测，胶质瘤细胞U87、U251、A172中Exon1a(-)/Exon1a(+)、Exon2(-)/Exon2(+)比值与正常星形胶质细胞HA1800中Exon1a(-)/Exon1a(+)、Exon2(-)/Exon2(+)比值比较，无显著性差异（P＞0.05）；胶质瘤细胞U87、U251、A172中Exon5a(-)/Exon5a(+)比值和正常星形胶质细胞中Exon5a(-)/Exon5a(+)比值比较，显著降低（P＜0.01）。 结论：胶质瘤细胞中GluR2Q/R位点的A-to-I编辑水平明显下降。胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中ADAR2mRNA前体均有3个剪接位点。其中Exon5a位点的剪接在胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中存在明显差别，Exon5a(+)转录本的表达增加可能是导致胶质瘤细胞中ADAR2编辑活性下降的原因。 第二部分Bcl-x剪接转换寡核苷酸诱导胶质瘤细胞凋亡的实验研究 目的：比较胶质瘤细胞U87、U251、A172和正常星形胶质细胞HA1800中Bcl-xmRNA前体选择性剪接模式的差异。探讨Bcl-x剪接转换寡核苷酸（Bcl-xSplice-switching oligonucleotides，Bcl-x SSO）对胶质瘤细胞株U251增殖和凋亡的影响。 方法：RT-PCR、real-time PCR结合Western blot方法检测胶质瘤细胞U87、U251、A172和正常星形胶质细胞HA1800中Bcl-xL和Bcl-xS的相对表达量，比较胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中Bcl-x mRNA前体选择性剪接模式的差异。设计靶向Bcl-x基因下游选择性5’端剪接位点的剪接转换寡核苷酸Bcl-x SSO，β-globin SSO作为阴性对照SSO。SSO经2’-甲氧乙基(2’-O-methoxyethyl，MOE）、全硫代磷酸化（phosphorothioate，PS）修饰。用脂质体将SSO转染至U251细胞。采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）检测Bcl-x SSO对U251细胞的增殖抑制率。流式细胞术定量检测U251细胞的凋亡率。RT-PCR方法检测Bcl-xSSO对Bcl-xL、Bcl-xS mRNA表达水平的影响，Western blot方法检测Bcl-x SSO对Bcl-xL、Bcl-xS蛋白表达的影响。 结果：胶质瘤细胞U87、U251、A172中，，Bcl-xL mRNA前体的选择性剪接存在异常，表现为Bcl-xL表达水平明显增高（P＜0.01），Bcl-xS表达水平明显降低（P＜0.01），Bcl-xS/Bcl-xL比值在胶质瘤细胞中明显低于正常胶质细胞（P＜0.01）。MTT结果显示，与Control SSO相比较，Bcl-x SSO显著抑制U251细胞的增殖，且抑制作用呈剂量依赖性（P＜0.01）。流式细胞术检测到Bcl-x SSO能够明显促进U251细胞凋亡。RT-PCR检测Bcl-x SSO处理组Bcl-xL mRNA表达水平下降，Bcl-xS mRNA表达水平升高。Western blot检测Bcl-x SSO处理组Bcl-xL蛋白表达水平下降，Bcl-xS蛋白表达水平升高（P＜0.01）。 结论：胶质瘤细胞中，Bcl-x mRNA前体的选择性剪接存在异常，在胶质瘤细胞中，Bcl-x SSO可特异性的作用于Bcl-x mRNA前体，调节其选择性剪接模式从Bcl-xL转换至Bcl-xS，进而促进U251细胞凋亡。
[Abstract]:Analysis of the selective splicing pattern of ADAR2mRNA in the first part of glioma cells 鏋

本文编号：1464759