锂—匹罗卡品致痫大鼠海马神经元线粒体分裂变化研究

发布时间：2018-01-27 01:07

  本文关键词： 癫痫 线粒体分裂 动力相关蛋白1 线粒体分裂蛋白抑制剂 细胞凋亡 神经保护　出处：《郑州大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景癫痫是多种病因所引起的反复发作的大脑神经元高度同步异常放电所致的脑功能失调为特征的慢性脑部疾病。癫痫的长期发作不仅对病人的生活质量产生严重的影响,而且对患者家庭及社会将会增加沉重的负担。癫痫发作可以导致神经元损伤,而神经元损伤又会明显增加其后癫痫发作的危险性,但是目前,癫痫发作导致神经元损伤的机制尚不完全清楚,而且针对癫痫发作导致的神经损伤的神经保护策略还很有限。线粒体作为真核生物细胞内具有两层膜的细胞器,在有氧氧化能量代谢,细胞信号分子传导和细胞凋亡方面发挥着整合平台的作用。由于神经细胞是生物体内能量代谢需求旺盛的细胞,所以尤其依赖线粒体的功能。近年来的癫痫研究中,线粒体功能障碍引起了极大的关注。活体细胞内的线粒体不断地进行着分裂/融合,是一个不断变化的细胞器。线粒体融合使线粒体变为长管状网状结构,线粒体分裂促使线粒体网状结构瓦解为片断。正常情况下,线粒体分裂和融合之间的动态平衡导致线粒体网络状结构和形态不断地发生着的重塑和变化,从而适应不同的生理活动需要。线粒体动态的网络结构对各种病理生理性刺激高度敏感,诸如氧化应激,缺血,老龄等异常病理情况均有可能导致线粒体分裂融合失衡。近来的研究关注到,线粒体分裂/融合紊乱在诸如肌萎缩侧索硬化,亨廷顿病,阿尔海默氏病及帕金森病等神经系统变性疾病的线粒体自噬,神经元损伤和凋亡等病理过程中发挥着重要作用。Drp1(dynamin-related protein 1)即动力相关蛋白1,是调控真核细胞线粒体分裂的关键蛋白。Mdivi-1(mitochondrial division inhibitor)通过失活三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate,GTP)酶,选择性地抑制动力相关蛋白1,从而发挥抑制线粒体分裂的作用。已经证实线粒体的氧化应激损伤参与癫痫的病理过程,但是目前,线粒体分裂在癫痫发作后神经损伤中的作用尚不清楚,线粒体分裂抑制剂Mdivi-1对癫痫发作导致的神经损伤是否具有神经保护作用及具体机制如何至今很少有报道。研究目的本研究通过建立的氯化锂-匹罗卡品癫痫模型,观察致痫及Mdivi-1预处理大鼠行为学,神经元缺失,细胞凋亡,海马神经元线粒体Drp1及凋亡相关物质细胞色素C、凋亡诱导因子AIF和半胱天冬酶3表达水平变化,研究线粒体分裂在癫痫神经元损伤中的作用,探讨癫痫神经元损伤的相关保护机制。材料与方法雄性健康成年的96只SD大鼠,体重在200-250g,随机分成正常对照组(CON组),匹罗卡品组(PILO组),匹罗卡品+二甲基亚砜阴性对照组(PILO+DMSO组),Mdivi-1干预组(PILO+Mdivi-1)组四组,PILO组,PILO+DMS组和PILO+Mdivi-1组三组大鼠腹腔注射氯化锂(127mg/kg)-匹罗卡品(30mg/kg)诱导癫痫持续状态癫痫。在注射匹罗卡品前30min,PILO+Mdivi-1和PILO+DMSO组组分别给予腹腔注射Mdivi-1(1.2mg/kg)和0.1%的二甲基亚砜(DMSO),CON组的大鼠给予等体积生理盐水用来代替匹罗卡品、二甲基亚砜及Mdivi-1。SE发作1h时,使用地西泮(10mg/kg)腹腔注射终止大鼠的癫痫发作。按照Racine标准对痫性发作级别进行判断,分别记录造模成功大鼠的潜伏期及致痫成功率。SE发作后24h,处死大鼠前对其脑电图进行描记,继之麻醉大鼠后进行断头取脑,大鼠的双侧海马被迅速地分离出来。大鼠海马Drp1 mRNA的表达水平使用RT-PCR法进行检测,大鼠海马Drp1、caspase-3、CytC和AIF的蛋白表达水平使用Western blot方法进行检测。SE后72h时,麻醉其余大鼠后,进行断头取脑。使用Nissl染色对大鼠海马神经元的缺失及损伤状况进行观测,使用TUNEL法对大鼠海马细胞凋亡情况进行观察。在本研究中,采用均数±标准差(x±s)来表示所有的研究数据资料,应用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计学分析。应用卡方检验(Chi-Square Tests)对致痫成功率进行比较,其余使用单因素方差分析(one-way analysis of variance)对组间数据进行比较,两组间比较采用LSD(Least—SignificantDifference)-t检验,以α=0.05作为研究的显著性水准。结果:1:大鼠的行为学表现及脑电图描记结果:正常对照组大鼠行为表现正常,无痫性发作,脑电图的描记结果正常;依据Racine标准的癫痫发作分级,在PILO、PILO+DMSO和PILO+Mdivi-1三组大鼠腹腔注射匹罗卡品以后,其癫痫发作级别可以达到Ⅳ-Ⅴ级,甚至出现癫痫持续状态;三组大鼠之间的发作潜伏期及致痫成功率无显著性的统计学差异(p0.05);匹罗卡品腹腔注射后,三组大鼠的脑电图描记到大量的高波幅的尖波、棘波,棘慢及尖慢综合波发放。2.病理学观察结果:2.1 Nissl染色观察结果:SE后72h时,与正常对照组相比,PILO、PILO+DMSO和PILO+Mdivi-1三组大鼠海马CA3区的神经元数目出现明显减少,可以发现有明显的神经元缺失统计学有显著性的差异(p0.05);在SE后72h时,与PILO组相比,PILO+DMSO组大鼠的海马CA3区神经元数目出现减少,统计学无显著性的差异(p0.05);PILO+Mdivi-1组大鼠海马的CA3区神经元数目出现明显的增多,统计学有显著性的差异(p0.05)。2.2细胞凋亡TUNE法检测结果:在SE后72h时,与正常对照组比,PILO、PILO+DMSO和PILO+Mdivi-1三组大鼠的海马CA3区存在有明显的细胞凋亡,有显著性的统计学差异(p0.05)。在SE后72h时,与PILO组相比,PILO+DMSO组大鼠海马CA3区的细胞凋亡出现增多,无显著性统计学差异(p0.05),PILO+Mdivi-1组大鼠的海马CA3区的细胞凋亡数目出现明显的减少,有显著性统计学差异(p0.05)。3.Western blot结果:与正常对照组相比,SE后24h时,PILO、PILO+DMSO和PILO+Mdivi-1三组大鼠海马存在有Drp1表达水平明显升高,caspase-3显著激活,CytC异常释放及AIF不正常移位,统计学有显著性差异(p0.05)。癫痫持续状态发作后24h时,与PILO组相比,PILO+DMSO组Drp1表达水平升高,PILO+DMSO组Cyt C释放、AIF移位和caspase-3激活增加,统计均无显著性差异(p0.05),PILO+Mdivi-1组大鼠海马Drp1表达水平降低,统计均无显著性差异(p0.05),而Cyt C释放、AIF移位和caspase-3激活减少,统计有显著性差异(p0.05)。4.RT-PCR结果:与CON组相比,在SE发作后24h时PILO组、PILO+DMSO组和PILO+Mdivi-1组三组大鼠海马Drp1 mRNA表达水平显著升高,差异有显著性(p0.05);SE后24h时与PILO组相比,PILO+DMS组及PILO+Mdivi-1组Drp1 mRNA表达水平降低。统计均无显著性差异(p0.05)。结论1.大鼠海马神经元Drp1及Drp1 mRNA的表达水平在癫痫持续状态后出现明显的增高,提示线粒体分裂很可能参与到了癫痫的病理损伤过程。2:线粒体分裂蛋白抑制剂Mdivi-1的神经保护作用可能是通过阻断致痫大鼠海马神经元凋亡时caspase-3显著激活,Cyt C异常释放及AIF不正常移位和来实现;抑制线粒体分裂有可能成为癫痫发作后神经损伤新的治疗策略。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.1

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本文编号：1467119