基于差示扫描量热法和蛋白质组学技术寻找脑脊液中胶质瘤恶性程度相关的生物学标志物

发布时间：2018-02-04 21:16

本文关键词：胶质母细胞瘤胶质瘤生物学标志物脑脊液肿瘤囊液差示扫描量热法蛋白质组学质谱生物信息学分析同位素标记相对和绝对定量基因本体论酶联免疫吸附试验中枢神经系统　出处：《复旦大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：在成人中枢神经系统(central nervous system, CNS)各种原发性肿瘤中,以胶质瘤(glioma)最常见是,约占60%,其中恶性程度最高的胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)又占全部胶质瘤的一半以上。GBM生物学上呈现侵袭性生长,手术无法全切。即便予以最大安全程度切除,辅助以放、化疗,肿瘤从原发灶复发几乎无法避免,患者复发率和死亡率仍很高。胶质瘤恶性程度特异性生物学标志物,被认为有望协助神经肿瘤医生早期、有效地诊断胶质瘤,监测治疗反应,预警复发,甚至用于开发胶质瘤患者的个体化治疗方案,因此是目前神经外科领域的研究热点之一。而脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)因为其特殊的生理位置与生物学功能,一直是寻找中枢神经系统疾病相关生物学标志物的重要样本来源。本课题的目的是通过比较不同恶性程度胶质瘤患者来源的CSF蛋白质组的改变,从宏观的物理学热稳定特征,到微观上的高丰度和低丰度蛋白质组成分,尝试寻找与胶质瘤恶性程度相关的生物学标志物,为后续临床研究和转化奠定一定的实验室基础。方法：在第一部分,我们选用了39例患者来源的样本,包括36个CSF样本和3个GBM肿瘤囊肿液(cystfluid, CF)样本,对其进行超滤浓缩、换盐、蛋白定量等预处理后,采用现代高灵敏度的差示扫描量热仪(differential scanning calorimeter, DSC),分析胶质瘤CSF的蛋白质组在不同疾病状态下整体热稳定性的改变,并通过ELISA的方法对CSF蛋白质组的高丰度组分(10种高丰度蛋白)进行定量,初步探讨热稳定性改变的可能机制；DSC的优点是快速简便,对样本预处理要求低,但是其描述的热力学参数仅是蛋白质组宏观上整体的物理特征,尚缺乏微观上,尤其是对疾病状态下低丰度蛋白质成分改变的直接检测能力,而以质谱技术为代表的蛋白质组技术平台,能很好地弥补这个不足。因此在第二部分,我们首先从Pubmed检索现有的基于胶质瘤CSF开展的蛋白质组研究工作,对它们进行系统综述,对不同研究采用的研究方案进行总结与比较,并归纳各项研究发现的差异表达蛋白(潜在生物学标志物)。在此基础上,通过应用PANTHER (Protein Analysis Through Evolutionary Relationships)分类系统及IPA (Ingenuity Pathway Analysis)软件等在线生物信息学方法,探寻不同研究发现之间是否存在一定的内在联系,并基于IPA网络寻找新的潜在胶质瘤CSF标志物,最后用ELISA的方法在我们自己收集的29例患者来源的样本(包括26个CSF样本和3个CF)中进行验证；在第二部分文献复习的基础上,我们在第三部分研究中选用了44例患者来源的样本(包括42个CSF样本和2个CF),首先用ProteoMiner试剂盒去除其中的高丰度蛋白并富集低丰度蛋白,然后样本通过过柱去盐,Bradford法蛋白定量,酶切肽段等处理后,应用iTRAQ标记结合二维纳升级反向液相色谱-电喷雾串联质谱技术,鉴定并相对定量分析样本中的蛋白成分,并依据不同筛选条件得到差异表达蛋白。对这些差异表达蛋白,首先结合生物信息学分析及文献检索的方法,初筛获得目前尚未在胶质瘤研究中报道的新的蛋白分子,然后用ELISA的方法在胶质瘤患者CSF中验证其组间差异表达的存在,最后在新收集的6例CSF中验证用这些差异蛋白去鉴别胶质瘤恶性程度的可靠性。除此之外,我们还收集了5例GBM组织的原代细胞上清和9种恶性肿瘤细胞系上清,后者包括4种人GBM细胞系(A172, U87, U251和SHG66),2种胶质瘤细胞系(H4和SW1783)和3种非胶质瘤肿瘤细胞系(K-562, AGS和N87),用ELISA的方法对鉴定到的新蛋白进行检测,探讨这些差异蛋白可能的来源。结果：在第一部分,我们发现非肿瘤对照组CSF的DSC曲线,其主要转变温度或熔解温度(melting temperature, Tm)是在73.20C,与之相比,良性脑肿瘤组与低级别胶质瘤(low grade glioma, LGG)组的Tm值分别升高到了73.8℃和74.1℃,而GBM组的Tm值升高最为明显(75.6℃),统计学分析发现GBM组与其它组之间的差异存在统计学意义(P0.001)。进一步检测样本总蛋白浓度后发现,来自GBM患者的CF样本显著高于其它CSF组(P0.001),而GBMCSF组也显著高于其它CSF组(P0.05或P0.01)。在10种被检测的高丰度蛋白中,5种蛋白(ALB, IgG, AGP, AAT和FIB)分别占CSF和CF中被检测蛋白总含量的99%和98%以上。除了AGP外,GBM患者CF中9种蛋白的含量显著性高于各组CSF(P0.05或P0.001)。而GBM CSF中ALB, IgG, AAT, FIB, APOA1和TRF等6种蛋白的浓度显著性高于其它CSF组。比较这些蛋白的相对含量后发现,CF中AAT, FIB, Cys-C和C3的相对含量较高,而在不同的CSF组间,GBM组CSF中IgG, AAT和TRF的相对含量较高,上述高丰度蛋白绝度和相对含量的改变,可能是蛋白质组总体Tm值变化的原因之一；在第二部分,根据预设的纳入和排除标准,一共检索到了8篇文献,共计有19种蛋白被上述文献验证为存在于胶质瘤患者来源CSF中的差异表达蛋白。根据GO注释与PANTHER分析,绝大部分这些差异表达蛋白的分子功能是“结合”,亚细胞定位为“细胞外区域”；值得注意的是,它们参与的生物学过程为“炎症反应”,“应激／缺氧应答”和“凋亡过程”等,提示它们可能参与了胶质瘤恶性进展和宿主抗肿瘤免疫应答等过程。根据HPA数据库,绝大部分这些蛋白在胶质瘤组织中的表达量与正常CNS组织相比是升高的。在这19种蛋白中,只有一种蛋白(attractin)被不同的文献重复鉴定到,而这可能是由于不同研究在具体采用的实验方案上存在差异所造成。IPA分析显示,这19种蛋白具有包括“炎症反应”、“癌症”、“细胞死亡和生存”在内的重要功能,参与了包括“急性期反应信号通路”、"VEGF信号通路”,“p38信号通路”等重要的通路,构建的第一个网络图的核心蛋白分子主要位于细胞核内(如MAPK3/MAPK1, HNRNPA2B1与CEBPA),具有DNA结合,催化活性和转录调节活性等生物学功能,而第二个网络图显示IL-6/STAT-3信号通路处于核心地位。据此,我们挑选了GAL, HSPA5, WNT和IL-6等4个节点蛋白,在本课题收集的CSF与CF中进行了验证,结果表明,GAL, HSPA5与WNT三个蛋白的含量在CF中显著性低于CSF,但是在不同CSF组间不存在统计学差异；而IL-6不仅在GBMCF中的浓度显著高于其他CSF组(P0.001),而且在GBM CSF中的浓度显著性高于其他恶性度较低胶质瘤组的CSF(P0.001),提示IL-6具有成为GBM生物学标志物的潜力；在第三部分,我们在经过低丰度蛋白富集后的CSF中总共鉴定得到445种蛋白成分。根据GO注释,它们的细胞定位主要集中于细胞外(24%)、细胞膜(13%)、细胞质(11%)、其它细胞内的细胞器(11%)等,参与的生物学过程主要是调节(22%)、细胞过程(18%)、代谢过程(9%)、对刺激反应(9%)等,具有的分子功能主要是结合(48%)、催化活性(22%)、蛋白酶调节活性(10%)等。在这445种蛋白中,144种蛋白的表达与星形细胞瘤恶性程度相关(WHO Ⅱ级→Ⅳ级：逐级上调84个,逐级下调60个),14种蛋白与胶质瘤瘤恶性程度相关(WHO Ⅰ级→Ⅳ级：逐级上调5个,逐级下调9个),17种蛋白在高级别胶质瘤(HGG)和LGG组间有显著性差异表达(上调3个,下调14个,P0.05),179种蛋白在原发和复发GBM组间有差异(上调超过2倍89个,下调超过2倍90个),135种蛋白在高级别少突胶质瘤和低级别少突胶质瘤之间有差异(上调超过2倍53个,下调超过2倍82个)。IPA分析显示,由这些差异蛋白构建的分子信号网络中,涉及的Top Functions主要有蛋白合成,脂质代谢和小分子生化,碳水化合物代谢,细胞间信号传导,免疫细胞迁移,体液性免疫应答,炎症反应,DNA复制、重组和修复,癌症,细胞运动,分子转运,细胞死亡和生存,细胞周期等。通过ELISA验证后,6种蛋白的含量被证实在GBM组CSF中的含量显著性高于其它恶性较低胶质瘤CSF组,它们分别是vinculin (VCL)蛋白、蛋白质二硫键异构酶A4(protein disulfide isomerase family A, member 4, PDIA4)、静止素Q6巯基氧化酶1 (quiescin Q6 sulfhydryl oxidase 1, QSOXl)、肌肽二肽酶(carnosine dipeptidase 1, CNDP1)、血小板因子4 (platelet factor 4, PF4)和分泌型卷曲相关蛋白3(secreted frizzled-related protein, SFRP3) 。比较上述蛋白在GBM组织原代细胞培养上清和CSF中的含量后发现,SFRP3和VCL,尤其是后者在细胞上清中的含量显著高于CSF,提示它们可能来源于肿瘤分泌。比较胶质瘤细胞系与非胶质瘤细胞系培养上清后发现,QSOX1、SFRP3和VCL在胶质瘤细胞系上清中的含量较高,提示它们的分泌可能具有胶质瘤特异性,尤其是QSOX1,其浓度在H4、SW1783和U87这三种恶性度逐级上升的细胞系上清中也呈现逐级升高的趋势,提示可能与胶质瘤恶性程度具有较好的相关性。上述蛋白在胶质瘤患者CSF和细胞上清中的差异表达,尚未见文献报道。结论：我们首次发现,基于CSF蛋白质组的热稳定性,快捷简便的DSC检测具有提示胶质瘤恶性程度的能力,而疾病状态下多种高丰度蛋白质成分的改变可能是Tm值改变的原因之一；由于DSC反映的是蛋白质组整体(特别是高丰度组分)的特征,因此利用高通量、高分辨率的蛋白质组质谱平台检测疾病状态相关的低丰度蛋白的改变,不失为DSC技术的有力互补。我们进而首次对现有的胶质瘤CSF质谱研究进行了系统综述,不仅总结了已报道的潜在生物学标志物,而且还验证了通过生物信息学方法发现的新的标志物(如IL-6)；我们最后还首次通过iTRAQ定量标记质谱技术对胶质瘤CSF蛋白质组进行了检测,发现了CNDP1、 PDIA4、QSOX1、PF4、SFRP3和VCL等在GBM与其它恶性度较低胶质瘤之间存在差异表达的蛋白分子,而上述发现均未见文献报道。这些胶质瘤相关的低丰度差异蛋白,其来源可能是肿瘤组织、肿瘤微环境或是机体反应性表达、分泌或释放进入CSF,不仅有望成为GBM患者CSF中的生物学标志物,而且也值得进一步研究阐明其起到的生物学功能。当然,质谱技术也有着昂贵、耗时费力等不足,因此可以充分利用DSC技术快捷简便的优点予以互补,本课题因此也为今后对这两种技术开展大规模样本验证以及临床应用奠定了一定的实验室研究基础。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.4

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