神经母细胞特异性转移因子（Ascl1）对人胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响
本文关键词： Ascl1 胶质瘤细胞 增殖 侵袭 细胞周期 出处：《宁夏医科大学》2017年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：目的:探讨神经母细胞特异性转移因子(Achaete-scute homolog 1,Ascl1)对人胶质瘤细胞株U87增殖和侵袭能力的影响,并初步探索其调控机制。方法:利用慢病毒载体将Ascl1基因整合到U87细胞染色体,构建Ascl1过表达的U87细胞系稳定株;通过观察绿色荧光表达、Western Blot实验和Q-PCR实验鉴定U87细胞中Ascl1的表达情况;CCK-8实验和BrdU掺入实验检测Ascl1对U87细胞增殖能力的影响;Transwell侵袭实验检测Ascl1对U87细胞侵袭能力的调节;流式细胞术检测Ascl1对U87细胞周期的调控;并通过Western Blot检测各组细胞内细胞周期相关蛋白c-myc、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、细胞周期素依赖性激酶4(Cyclin-dependent kinases4,CDK4)和P27的表达变化,初步揭示Ascl1调节U87细胞增殖侵袭能力的机制。结果:绿色荧光表达、Western Blot和Q-PCR实验证实,U87细胞转染慢病毒后高表达Ascl1,转染效率可达90%以上,Ascl1基因成功整合到U87细胞染色体,构建了Ascl1过表达的U87细胞系稳定株;与对照组U87细胞相比,CCK-8实验结果表明,过表达Ascl1的U87细胞在450nm处光密度值(OD值)下降(P0.01),BrdU掺入实验表明,转染Ascl1后U87细胞BrdU阳性细胞率降低(P0.01),提示Ascl1能降低U87细胞的增殖能力;Transwell侵袭实验证明过表达Ascl1的U87细胞穿过小室基底膜的细胞数减少(P0.01),提示Ascl1能降低U87细胞的侵袭性;流式细胞术表明Ascl1使U87细胞的细胞周期受阻于G0/G1期,G1期向S期转换受到抑制(P0.01);同时,Ascl1能下调细胞周期相关蛋白c-myc、Cyclin D1和CDK4的表达,并上调P27的表达(均P0.01),表明Ascl1对U87细胞增殖和侵袭能力的抑制与细胞周期阻滞有关。结论:Ascl1能够降低人胶质瘤细胞U87的增殖和侵袭能力,该抑制作用与细胞周期的调控有关。
[Abstract]:Aim: to investigate the effects of neuroblaste-specific transfer factor Achaete-scute homolog 1 (Ascl1) on the proliferation and invasion of human glioma cell line U87, and to explore its regulatory mechanism. Methods: the Ascl1 gene was integrated into the chromosome of U87 cells by lentivirus vector. A stable U87 cell line with overexpression of Ascl1 was constructed. The expression of Ascl1 in U87 cells was evaluated by observing the expression of Ascl1 in U87 cells by observing the expression of green fluorescent Blot and Q-PCR. The effect of Ascl1 on the proliferation of U87 cells was detected by CCK-8 assay and BrdU incorporation assay. The regulation of Ascl1 on the invasion ability of U87 cells was detected by transwell invasion assay. Flow cytometry was used to detect the regulation of U87 cell cycle by Ascl1, and the expression of c-myc, D1cyclin D1C, cyclin dependent kinases4CDK4) and P27 were detected by Western Blot. Results: Western Blot and Q-PCR results showed that U87 cells overexpressed ASCL 1 after transfection of lentivirus, and the transfection efficiency was more than 90% and the gene was successfully integrated into the chromosome of U87 cells. A stable U87 cell line with overexpression of Ascl1 was constructed, and the results of CCK-8 assay showed that the over-expression of Ascl1 in U87 cells decreased P0.01BrdU incorporation at 450 nm. After transfection of Ascl1, the rate of BrdU positive cells in U87 cells decreased, suggesting that Ascl1 could reduce the proliferation ability of U87 cells. Transwell invasion experiment showed that the number of U87 cells that expressed Ascl1 decreased through the basement membrane of the cell. It suggested that Ascl1 could reduce the invasiveness of U87 cells. Flow cytometry showed that Ascl1 inhibited cell cycle transition from G _ 0 / G _ 1 phase to S phase in U87 cells, and Ascl1 could down-regulate the expression of c-myc cyclin D1 and CDK4 in U87 cells. The expression of P27 was up-regulated (all P0.01a), which indicated that the inhibition of proliferation and invasion of U87 cells by Ascl1 was related to cell cycle arrest. Conclusion the cell cycle arrest is associated with the decrease of proliferation and invasion ability of human glioma cell line U87 by 1: Ascl1, which is related to the regulation of cell cycle.
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.41
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本文编号：1496738
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