受体相互作用蛋白激酶-1在紫草素诱导脑胶质瘤细胞程序性坏死中的作用及机制研究

发布时间：2018-02-09 05:35

  本文关键词： 紫草素 胶质瘤 程序性坏死 受体相互作用蛋白激酶-1 活性氧　出处：《吉林大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景： 胶质瘤是神经系统最常见的颅内原发性恶性肿瘤，据报道，该肿瘤占颅内原发肿瘤的35.26%～60.96%[1]。由于恶性胶质瘤在中枢神经系统呈浸润性快速生长等特点决定了外科手术不能将肿瘤全部清除干净，并且恶性胶质瘤细胞能够耐受术后的放疗和化疗，所以虽然临床上采用了外科手术、放射治疗、化学药物治疗、生物治疗等多种措施综合治疗仍然难于根治[3]。通过上述标准治疗方案治疗后，患者的中位总生存期也仅仅在14-16个月[4]，最近的研究显示：恶性胶质瘤细胞耐受放疗及化疗的主要原因是胶质瘤细胞抵抗细胞凋亡[23]。所以研发能够诱导胶质瘤细胞死亡的新途径的新药显得十分重要。 大量的研究曾报道shikonin能够诱导乳腺癌、肝细胞癌以及胶质瘤等多种肿瘤细胞凋亡[18-21]，然而，Han WD等研究证实shikonin能够诱导白血病细胞发生Necroptosis，该作用能有效的规避肿瘤化疗中的耐药性问题[22]，因此，紫草素能否诱导脑胶质瘤细胞产生Necroptosis仍需进一步实验证实，，证实这个问题能够帮助我们进一步明确紫草素抗胶质瘤的具体机制，为临床上克服肿瘤细胞化疗的难题提供有力的实验与理论指导。 目的： 本研究中，我们采用大鼠胶质瘤细胞C6及人脑胶质瘤细胞U87探讨紫草素能否诱导脑胶质瘤细胞程序性坏死以及受体相互作用蛋白激酶-1在紫草素诱导脑胶质瘤细胞程序性坏死中的作用。 方法： 1、通过MTT法检测紫草素诱导胶质瘤细胞的死亡率，并且进一步探索necrotatin-1（Nec-1）、z-VAD-fmk以及NAC对该种细胞死亡的作用。 2、通过Annexin V-FITC/PI(propidium iodide)双染色法用流式细胞仪检测紫草素诱导胶质瘤细胞的死亡方式。 3、通过透射电镜直接观察紫草素处理过的胶质瘤细胞的形态学改变。 4、通过Hoechst33342及PI双染色用荧光显微镜观察紫草素处理过的胶质瘤细胞形态学变化。 5、通过DCFH-DA探针处理观察紫草素处理后的胶质瘤细胞的ROS水平的变化。 6、通过Western blot分析程序性坏死相关蛋白RIP-1的表达水平的变化。 结果： 1、MTT检测细胞成活率显示：紫草素能够诱导C6及U87胶质瘤细胞死亡，并且在一定范围内呈现时间和浓度依赖性，紫草素诱导的细胞死亡能够被程序性死亡特异性抑制剂necrotatin-1（Nec-1）特异性阻断，而不能被泛caspase抑制剂z-VAD-fmk阻断，并且实验结果还显示:抗氧化剂NAC能够明显抑制紫草素诱导的细胞死亡。 2、Annexin V-FITC和PI双染色通过流式细胞仪检测细胞的死亡方式，结果显示：不同浓度的紫草素处理C6及U87胶质瘤细胞3h后，Annexin V-/Pl+区域和Annexin V+/Pl+区域的细胞百分比明显增加，并且呈现时间和浓度依赖性，该区域的细胞百分比增加能够被程序性死亡特异性抑制剂Nec-1阻断，而不能被泛caspase抑制剂z-VAD-fmk阻断。 3、透射电镜观察紫草素处理过的胶质瘤细胞的形态学表现为：正常的C6胶质瘤细胞微绒毛突出于表面，细胞核核膜平滑，细胞器状态良好。但是经过紫草素处理后细胞的细胞内电子密度明显降低，细胞膜完整性被破坏，核膜完整性丧失。 4、荧光显微镜观察紫草素处理过的C6胶质瘤细胞经Hoechst33342及PI双染色后细胞形态及着色的不同。荧光显微镜下表现为正常状态的C6细胞的细胞核形态正常为圆形并且被染色成深蓝色，而紫草素处理过的细胞部分细胞核形态正常，但是染色成深蓝色和红色，还有部分细胞核皱缩，被染色成淡蓝色和红色，而经过Nec-1预处理之后紫草素作用的细胞，染色显示细胞核形态正常但染色成深蓝色和红色的部分明显减少，而呈现细胞核皱缩被染色成淡蓝色和红色的细胞未见明显减少。 5、DCFH-DA探针处理观察处理后细胞的ROS水平的变化，荧光显微镜下表现为：紫草素处理后的细胞内ROS浓度明显升高、荧光颜色明显变亮，该ROS浓度能够被Nec-1及抗氧化剂NAC降低，并且它们引起的降低也降低了细胞的死亡率。 6、Western blot分析程序性坏死相关蛋白RIP-1的表达变化，实验结果显示：RIP-1的表达水平与紫草素处理呈现浓度及时间依赖性，并且RIP-1的表达水平不仅能够被Nec-1抑制，也能够被NAC降低。 结论： 1、紫草素能够明显诱导胶质瘤细胞死亡，并且主要是通过诱导细胞程序性坏死实现的。 2、紫草素诱导胶质瘤细胞程序性坏死是通过诱导RIP-1高表达实现的。 3、紫草素诱导胶质瘤细胞发生程序性坏死的过程中有大量ROS的产生，抑制ROS能够明显抑制Necroptosis的发生。
[Abstract]:Background:
Glioma is the most common intracranial primary malignant tumor of the nervous system, according to the report, the tumor was the primary intracranial tumor in 35.26% ~ 60.96%[1]. due to Malignant Glioma Infiltrating characteristics of fast growth determines the surgery can not be cleared of all tumors in the central nervous system, and malignant glioma cells can be tolerated after surgery the radiotherapy and chemotherapy, although the clinical use of surgery, radiotherapy, chemotherapy, biological therapy and other comprehensive treatment measures is still difficult to cure [3]. through the standard treatment after treatment, patients with a median overall survival was only 14-16 months [4], recent studies have shown that: the main reason of radiotherapy and the chemotherapy of malignant glioma cell tolerance is drug resistance to apoptosis of [23]. glioma cells so the development of new ways to induce glioma cell death was ten It's important.
A large number of studies have reported that shikonin can induce breast cancer, hepatocellular carcinoma and glioma tumor cell apoptosis in [18-21], however, Han WD confirmed that shikonin could induce leukemia cells Necroptosis, which can avoid the chemotherapy drug resistance [22], effective therefore, shikonin can induce glioma cells Necroptosis still needs further experiments, confirmed that this problem can help us to further clarify the shikonin anti glioma specific mechanism, to provide experimental and theoretical guidance for the clinical effective to overcome the problem of tumor cells in chemotherapy.
Objective:
In this study, we used rat glioma cells C6 and human glioma cell U87 to explore whether shikonin can induce glioma cell necrosis and receptor interacting protein kinase -1 in shikonin induced glioma cell programmed necrosis.
Method锛

本文编号：1497198