小鼠M2型小胶质细胞保护海马神经元免除KA诱导的神经毒性作用

发布时间：2018-02-12 06:20

  本文关键词： 海人藻酸 海马神经元 神经毒性损伤 小胶质细胞 细胞因子　出处：《吉林大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：兴奋性毒性是人类中枢神经系统的多种退行性疾病的重要发病机制。海人藻酸（KA）诱导啮齿类动物出现兴奋性毒性损伤是研究人类神经退行性变的有效模型。相关研究证实小胶质细胞和星形胶质细胞的激活与KA致神经元死亡密切相关。其中小胶质细胞（Microglia）在神经炎性及退行性疾病发生发展中的作用具有两面性，即不同亚型的Microglia可分别发挥促炎（M1型）或抗炎（M2型）作用。因此，本实验通过体外诱导小胶质细胞向不同亚型分化，检测M2型小胶质细胞对神经细胞的保护作用及其减轻神经系统的炎症反应的分子生物学机制，为神经炎性疾病的免疫治疗提供新的思路和治疗靶点。 目的： 本研究应用KA诱导建立原代培养的小鼠海马神经元毒性损伤模型，并对新生小鼠的小胶质细胞进行原代培养、分选及诱导分化，建立海马神经元与分化后的小胶质细胞体外共培养模型，探讨不同亚型小胶质细胞在KA诱导的神经毒性过程中的不同作用，意在阐明M2型小胶质细胞可保护海马神经元免受KA诱导的神经毒性作用及其抗炎机制。 方法： （1）取E16-18胎鼠大脑行海马神经元原代培养，再应用KA诱导建立神经元毒性损伤模型后，通过检测CCK8、NO含量、LDH含量评估神经损伤程度及机制；（2）取P1-P3新生小鼠行小胶质细胞原代培养，应用免疫磁珠进行分选后加入不同组合的细胞因子进行诱导分化，以流式细胞仪对分化后的小胶质细胞M1/M2进行表型鉴定，并以ELISA测定分化后的M1/M2分泌的细胞因子含量；（3）建立海马神经元与分化后的小胶质细胞体外共培养模型，通过检测CCK8、NO和LDH产量评估共培养的小胶质细胞对神经元活性的影响及损伤程度，并在共培养24小时后加入KA刺激24小时，检测CCK8、LDH含量评估不同亚型小胶质细胞M1/M2与神经元共培养对KA致神经元损伤的影响，Western Blot检测NFκB蛋白表达水平。 结果： 1）KA可对原代培养的海马神经元造成兴奋性毒性损伤。在200uM KA刺激24小时后，，大部分的海马神经元出现死亡及轴突损伤，神经元活性CCK8仅为51.7±8.6%，LDH和NO产量明显增加，Western Blot结果提示KA致神经元损伤后NFκB及Caspase3表达水平明显升高。 2）小胶质细胞原代培养后应用抗CD11b免疫磁珠可成功进行小胶质细胞的分选，流式细胞仪显示CD11b阳性率可达92.7±5.3%。 3）以LPS和IFNγ联合刺激可诱导小胶质细胞向M1型分化，呈现“阿米巴样”活化状态，细胞胞体变大，突起回缩变粗、变短，流式细胞仪表型测定结果显示iNOS+, CD40+, IL-12/23p40high, IL-10low，符合M1型的特异性表型标志。ELISA检测结果显示分化后的M1型小胶质细胞可分泌高水平的促炎细胞因子（TNF-α、IFN-γ和IL-6），明显高于对照组和M2型（P0.01，n=3）。 4）IL-4，IL-10和TGF-β联合刺激可诱导小胶质细胞向M2型分化，细胞胞体变小、细长，突起变少、形成较长、粗大的突起。流式细胞仪表型鉴定显示CD206+, Arg-1+, IL-12/23p40low, IL-10high，符合M2型的特异性表型标志,。ELISA检测结果显示分化后的M2型小胶质细胞可分泌高水平的抗炎细胞因子（IL-4和IL-10），明显高于对照组和M1型（P0.01，n=3）。 5）成功建立海马神经元与分化后的小胶质细胞体外共培养模型。分化后M1型小胶质细胞与海马神经元共培养可造成大部分海马神经元死亡、轴突断裂，共培养24小时后神经元活性CCK8仅为51.59%±19.40%（n=3），LDH和NO产量明显增高；而与M2型小胶质细胞共培养的神经元活性无明显影响，CCK8为96.60%±3.21%（n=3），LDH和NO产量略升高，Western Blot检测NFκB蛋白表达水平显示N+M1组明显高于N+M2组，两组间比较有显著性差异（P0.01）。 6）与M1型小胶质细胞共培养的神经元再加入KA刺激后出现神经元损伤加重，神经元活性CCK8仅为32.36%±11.13%，LDH和NO产量明显增高；而与M2型小胶质细胞共培养的神经元在加入KA刺激后仅有轻度轴突损伤、少许细胞死亡，CCK8为80.39%±11.81%，NO产量无明显升高，Western Blot检测NFκB蛋白表达水平显示N+M1+KA组明显高于N+M2+KA组，两组间比较有显著性差异（P0.05）。 结论： 1) KA体外诱导可成功建立海马神经元兴奋性毒性损伤模型。KA可能通过上调NFκB及Caspase3信号途径发挥诱导神经元凋亡的作用。 2)体外培养的小胶质细胞可在LPS和IFN-γ联合作用下分化为M1亚型，在IL-4、IL-10和TGF-β联合作用下分化为M2亚型，两者可表达相应的表型标志和分泌相应的细胞因子。 3)诱导分化后的M1型小胶质细胞可导致共培养的海马神经元出现损伤，且可加重KA对神经元的兴奋性毒性损伤；而分化后的M2型小胶质细胞则对共培养的海马神经元无损伤，且可在体外保护海马神经元免受KA诱导的神经毒性作用。 4) M2型小胶质细胞可能通过分泌抗炎细胞因子、抑制NO产生、下调NFκB等信号途径来保护神经元免受KA的毒性损伤作用，M1型小胶质细胞则通过相反的途径来加重神经元的毒性损伤。
[Abstract]:Excitotoxicity is an important pathogenesis of various neurodegenerative disease of the human central nervous system. Kainic acid (KA) induced rodent animal excitotoxic injury is an effective model to study human neurodegeneration. Studies have shown that activation of microglia and astrocytes and KA induced neuronal death is closely related which microglia (Microglia) in inflammatory and degenerative disorders in the occurrence and development of function has two sides, namely the different subtypes of Microglia can play a proinflammatory or anti-inflammatory (type M1) (type M2). Therefore, this experiment in vitro induced microglial cell differentiation to different molecular subtypes the biological mechanism of inflammation protective effect of detection of M2 microglia on nerve cells and relieve the nervous system, provide ideas and new therapeutic targets for immunotherapy of neuroinflammatory diseases.
Objective:
The establishment of mouse hippocampal neuron injury model induced cultured in this study by KA, and the neonatal mouse microglial cells were cultured, sorting and differentiation, in vitro differentiation of hippocampal neurons and microglial cells after co culture model, to explore the different effects of different subtypes of microglia in KA induced neurotoxicity in M2, to clarify the microglia can protect hippocampal neurons against neurotoxicity and its anti inflammation mechanism induced by KA.
Method锛

本文编号：1504978