环状RNA在脑胶质瘤中的差异表达与功能研究

发布时间：2018-02-14 08:58

  本文关键词： 环状RNA 高通量测序 胶质母细胞瘤 生物信息学分析 胶质瘤 circBRAF PFS OS 过表达质粒 胶质瘤 circBRAF 迁移 侵袭　出处：《第二军医大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤。目前针对胶质瘤的治疗方法包括手术切除、放射治疗及以替莫唑胺为主的化疗,纵使经过手术及术后的放化疗,高级别胶质瘤特别是胶质母细胞瘤的预后仍非常差,严重威胁人类生命健康。随着医学的发展进步,人们对胶质瘤的认识也逐步深入。胶质瘤的发生发展是个极其复杂的过程,阐明胶质瘤发生发展的分子机制,进而寻找早期诊断、预后判断及治疗靶点的新的分子标记物具有重要意义。近年来的研究发现环状RNA与多种肿瘤的发生发展有着密切的联系。环状RNA(circRNA)是一类单链的闭合的环状非编码RNA,既没有5’端,也没有3’端的多聚A尾。由于它特殊的稳定结构,使它不会被RNA酶降解,在进化上存在保守性。近年来的研究发现circRNAs可作为竞争性内源RNA(ceRNA)或miRNA海绵而发挥重要作用。基于circRNAs的这些特点,对circRNAs的研究可能为药物的开发提供新思路,为研究生命的进化提供新方向,作为一种生物标志物。随着高通量测序技术的发展,运用这一技术筛选出了大量肿瘤中差异表达的circRNAs,并为后续的深入研究中揭示了部分circRNAs在肿瘤的发生发展中的重要作用。这些研究主要集中在肝癌、结肠癌、宫颈癌等,circRNAs在胶质瘤中的表达及其功能研究较少。因此,我们运用高通量测序技术对5例胶质母细胞瘤和5例正常脑组织进行了circRNA测序,构建了胶质母细胞瘤的circRNAs表达谱,并比较计算出胶质母细胞瘤中差异表达的circRNAs。通过对差异表达的circRNAs生物信息学分析,推测其可能发挥的作用。从而为阐明胶质瘤的分子生物学机制奠定一定的基础。根据差异表达的circRNAs的生物信息分析结果,我们从下调表达的circRNAs中挑选了一个circRNAs在68例不同级别脑胶质瘤和13例正常脑组织中验证其表达水平,并与胶质瘤患者的预后行相关性分析。另外我们利用质粒载体构建了过表达质粒,并对胶质母细胞瘤细胞系U251转染,进行一系列功能学实验验证过表达该circRNAs后对胶质瘤细胞系的生物学特性的影响,为今后以circRNAs为切入点的胶质瘤的诊断与治疗进行初步探索。第一部分环状RNA在胶质母细胞瘤与正常脑组织中的差异表达及生物信息学分析目的:构建胶质母细胞瘤和正常脑组织中circRNAs的表达谱,分析差异表达的circRNAs可能的作用,为后续靶定研究与胶质瘤的发生发展有关的circRNAs提供基础。方法:对5例胶质母细胞瘤和5例正常脑组织提取总RNA,使用circRNA Enrichment Kit(cloud-seq,USA)富集circRNAs,用truseq stranded total RNA library prep kit(Illumina,San Diego,CA,USA)预处理RNA并构建测序文库(10个),将文库变性为单链DNA分子,在Illuminaflowcell上捕获并原位扩增为簇,运用Illumina HiSeq测序仪进行150循环的circRNAs测序,获取经过质控后的双端reads,用STAR软件将这些reads比对到参考基因组/转录组(Hg19)上,运用DCC软件行circRNAs检测和鉴定,并运用circBase和circ2Trait数据库对所鉴定的circRNAs进行注释。使用总reads对每个样品的原始junction reads进行标准化并行log2转化。运用t-test计算circRNAs在两组间差异的显著性,取差异倍数大于等于2倍且p≤0.05的circRNAs。对差异circRNAs的来源基因进行GO分析和KEGG通路分析,并用mi RNA靶基因预测软件TargetScan和Miranda进行circRNAs-microRNA相互作用预测,使用Cytoscape软件构建circRNAs-microRNA网络图。结果:在10个组织标本中共有50386个circRNAs,其中有1411个circRNAs在两组间表达有显著性差异,206个circRNAs在GBM组上调表达,1205个circRNAs在GBM组下调表达。GO分析显示在肿瘤组上调表达的circRNAs在生物学途径涉及了生物学途径(BP)35项,细胞组份(CC)31项,分子功能(MF)12条目。下调表达的circRNAs在BP涉及了663项,CC146项,MF150项。KEGG通路分析发现上调表达的circRNAs没有富集的信号通路,而下调表达的circRNAs共有70条信号通路。circRNAs-microRNA相互作用网络图显示,一个circRNAs可对应多个microRNA,而一个microRNA也可以与多个circRNAs有相互作用关系。结论:(1)在GBM和正常脑组织中circRNAs存在非常大量circRNAs,且存在大量差异表达的circRNAs,这些差异表达的circRNAs可能与胶质瘤的发生发展密切相关。(2)差异表达circRNAs的GO分析和KEGG通路分析显示它们可能参与了信号转导、肿瘤细胞增殖及多种肿瘤相关的生物学过程,总体上反映了circRNAs在胶质瘤的发生发展过程中发挥重要的作用。(3)、circRNAs-microRNA网络图提示circRNAs与microRNA有着复杂的调控关系,其具体调控机制有待进一步研究。第二部分环状RNA circBRAF在不同级别脑胶质瘤中的表达及其与预后的关系研究目的:比较circBRAF在不同级别胶质瘤中的表达情况,并分析circBRAF的表达水平与预后的相关性。方法:用realtime PCR的方法检测circBRAF在68例不同级别脑胶质瘤及13例正常脑组织中的表达水平,统计分析其表达水平与患者预后的相关性。结果:circBRAF的表达水平在正常脑组织中明显高于肿瘤组织中,且与肿瘤级别呈负相关(p0.01),生存分析显示circBRAF的表达水平与无进展生存(PFS)及总体生存(OS)呈正相关。结论:circBRAF的表达量随肿瘤级别的增高而降低,且与患者预后呈明显的正相关,因此我们推测circBRAF表达下降促进了胶质瘤的发生。第三部分环状RNA circBRAF在脑胶质瘤中的功能研究目的:初步研究探讨过表达circBRAF在胶质瘤细胞系U251中的功能方法:构建circBRAF过表达质粒,通过转染使U251细胞过表达circBRAF基因,运用realtime PCR检测过表达效率,质粒转染24小时后行功能学实验检测过表达circBRAF后对U251细胞的生物学特性的影响。结果:U251细胞转染circBRAF过表达质粒后circBRAF表达量明显增多。transwell迁移实验显示过表达circBRAF后,细胞的迁移能力明显下降;transwell侵袭实验显示过表达circBRAF后,细胞的侵袭能力明显下降。结论:过表达circBRAF的表达后能明显抑制胶质瘤细胞系U251细胞的迁移与侵袭能力。
[Abstract]:In recent years , we used high - throughput sequencing to study the molecular mechanism of glioma . The results showed that : ( 1 ) There was a significant difference between the two groups . The results showed that : ( 1 ) There was a significant difference between the two groups . The results showed that : ( 1 ) There was a significant difference between the two groups . The results showed that : ( 1 ) There was a significant difference between the two groups . Objective : To investigate the expression of BRAF in glioma cell line U251 and to investigate the relationship between expression level and prognosis of glioma cell line U251 .

【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.41

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本文编号：1510334