自噬诱导胶质瘤干细胞VEGFR-2的活化促进血管拟态的形成

发布时间：2018-02-20 22:41

  本文关键词： Atg5 自噬 胶质瘤干细胞(glioma stem cells GSCs) 血管拟态(VM) 血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2) 三维(three dimensional 3D)培养　出处：《第三军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肿瘤生长和转移依赖肿瘤血管新生(neovascularization)。目前有关肿瘤血管新生和发生机制的研究报道很多,抗血管生成(antiangiogenesis)治疗肿瘤的新方法也得到了临床应用。然而,目前抗血管生成治疗方法和疗效有限,主要原因是对经典血管生成途径以外的机制认识不足,缺乏治疗策略。经典的肿瘤血管新生途径包括血管生成(angiogenesis)和血管发生(vasculogenesis)。近些年人们还发现肿瘤细胞还可以通过自身变形、围绕形成管腔,以一种独立于内皮细胞依赖性血管的血管拟态(vasculogenic mimicry,VM)方式构筑肿瘤微循环。我们前期的研究发现,胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)具有形成VM的能力,是VM形成中的关键细胞;VEGFR-2在介导GSCs形成VM中起关键作用。目前发现VM对针对VEGF的抗血管生成治疗(如贝伐单抗)缺乏反应。同时我们也观察到,在无VEGF环境下(贝伐单抗),GSCs仍能形成管型样结构(VM),同时伴有VEGFR-2-Y1175位点磷酸化及自噬囊泡形成增多。这提示VM形成过程中VEGFR-2活化途径可能存在VEGF依赖和非依赖两种方式,自噬可能是VEGFR-2非VEGF依赖的活化途径之一。自噬(autophagy)是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子等物质的过程,与细胞生存、生长、分化及内环境稳定有非常重要的关系,参与生命过程的各个方面。近年自噬的研究进展对包括肿瘤在内的许多疾病的发病机制和防治策略提出新的观点。已有研究显示,自噬在肿瘤中的作用复杂,且存在争议。但目前多数学者认为,瘤细胞在缺乏氧、营养及生长因子的微环境中通过形成自噬降解自身折叠错误的蛋白质和受损细胞器来维持生存。目前研究显示,VM和自噬在形成条件和机制上有相似之处。首先,VM通过瘤细胞自身变形形成,且出现在肿瘤快速生长、血供不足的早期及进展期的缺乏血管区;同样,瘤细胞在缺乏营养和氧供应时,通过自身胞内单层或双层膜包裹形成自噬体,维持细胞生存。其次,自噬和VM均为基因调控下的适应和重整微环境的过程。再次,最近有文献报道,恶性黑色素瘤的VM形成细胞高表达自噬相关蛋白,微管相关蛋白-1轻链3(LC3)。提示,自噬可能参与了肿瘤VM形成。为了进一步了解自噬在VM形成中的作用和机制,以及贝伐单抗(bevacizumab,BEV)抗血管治疗引起VM形成的原因,我们首先建立和验证了新的VM的GSCs的三维(three dimensional,3D)培养模型,并以模型为基础,观察形成VM细胞的自噬情况;通过上调和下调自噬水平,观察对VM形成的影响;然后探讨自噬调控VM形成的机制以及BEV治疗GSCs引起VM增多的原因和抗自噬在其中的作用;最后检测人胶质母细胞瘤组织自噬相关基因Atg5、p-VEGFR-2蛋白表达和VM形成情况及相互和预后关系。主要得到的结果和结论如下:1.体外3D支架培养VM模型的建立。我们将从胶质母细胞瘤细胞系U87和原代胶质母细胞瘤细胞获得的细胞球种植于3D胶原支架内,分别用DMEM+10%胎牛血清、干细胞培养基(stem cell culture medium,STM)和内皮细胞培养基培养(endothelial cells basal medium,EBM)培养3天后,采用HE染色、免疫荧光标记和扫描电镜观察,以及蛋白印迹(western blotting,WB)实验,结果显示:(1)EBM诱导形成的管腔样结构高表达VM相关蛋白VE-Cadherin和Laminin B2,同时有VEGFR-2及其磷酸化表达水平的明显升高;(2)HE染色、免疫荧光染色和扫描电镜下发现仅在内皮细胞培养基的培养下,GCSs才能形成管腔样结构。上述结果表明,建立的新的VM体外3D培养模型是很好的培养模型。2.自噬通过不依赖VEGF-A途径活化VEGFR-2诱导GSCs形成VM。(1)GSCs转染EGFP-LC3腺病毒后,激光共聚焦显微镜下观察到瘤细胞浆内绿色点状的自噬体数量在EBM培养下显著高于其余两组(P0.001);WB检测可见EBM培养下比其他两组高表达自噬相关蛋白Atg7、Atg5和LC3,p62蛋白的表达水平与自噬水平呈反比,可见EBM组p62的水平较低,也说明自噬水平较高;(2)在EBM培养下,形成的管腔样结构共表达LC3和VM相关蛋白VE-Cadherin和Laminin B2;(3)自噬激动剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)处理的GSCs自噬体数量显著高于对照组(P0.01);同时共聚焦显微镜下能观察到RAPA组VM数量明显高于对照组(P0.01);WB检测可见RAPA组LC3的表达增加,p62表达下调,VM相关蛋白VE-Cadherin和Laminin B2表达水平升高以及VEGFR-2和其磷酸化水平的升高;(4)自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)处理后GSCs形成的自噬体数量显著高于对照组,P0.01,但WB检测虽然CQ组LC3的表达上调,但同时有p62水平的升高,说明细胞整体的自噬水平处于下调状态;同时在共聚焦显微镜下能观察到CQ组形成VM的数量明显低于对照组(P0.01);另可见VM相关蛋白VE-Cadherin和Laminin B2水平的下调以及VEGFR-2和其磷酸化水平的降低;(5)慢病毒敲低GSCs的Atg5基因共聚焦显微镜下可见shAtg5组的绿色荧光显著减少(P0.01);VM数量sh Atg5组明显低于对照组(P0.01);WB检测可见VM相关蛋白VE-Cadherin和Laminin B2水平的下调以及VEGFR-2和其磷酸化水平的降低;(6)WB实验可见BEV处理GSCs后VM相关蛋白VE-Cadherin和Laminin B2水平升高,同时有VEGFR-2和其磷酸化水平的升高和p62蛋白表达水平的下降,加入CQ后使p62蛋白表达水平升高,VE-Cadherin和Laminin B2蛋白水平以及VEGFR-2和其磷酸化水平下调;shAtg5下调VEGFR-2和其磷酸化水平,而BEV引起的VEGFR-2和其磷酸化水平的上调可以被敲低Atg5所抵消;(7)激光共聚焦显微镜可见EBM培养下活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)荧光强度较其他两组明显升高,当加入CQ后ROS水平的下降,而加入雷帕霉素ROS水平升高;流式细胞术检测见BEV诱导的ROS水平的上调可以被CQ降低;WB实验可见ROS的抑制剂NAC抑制BEV诱导的ROS,同时降低VEGFR-2和其磷酸化水平,但p62和LC3蛋白水平没有明显变化。上述结果表明,自噬通过调控ROS水平来诱导VEGFR-2和其磷酸化水平来调控VM的生成,该过程是非依赖于VEGF-A的。BEV会诱导自噬水平升高和VM的生成,联用自噬抑制剂CQ可以降低自噬及ROS水平和VM的生成。3.下调自噬水平降低贝伐单抗诱导的移植瘤血管拟态的形成。(1)双染CD34+PAS示BEV可以抑制原位种植NOD/SCID小鼠移植瘤血管的生成,但VM的数量增加(P0.01),当敲低Atg5后VM的数量不会增加;(2)CQ和BEV各自均能使NOD-SCID小鼠GSCs原位移植瘤的体积缩小,两者共同使用更加明显(P0.01),但BEV使VM的数量明显增加(P0.01);CQ虽然不能降低微血管密度,却能明显的降低肿瘤自身产生的和BEV诱导的VM数量;免疫组化染色Atg5可见BEV治疗使移植瘤细胞的Atg5表达水平上调,而CQ可以明显降低Atg5水平及其引起的VM数量(P0.01)。上述结果表明,BEV治疗会诱导VM形成,同时Atg5表达升高。抑制自噬后能降低VM的形成,提高BEV的疗效。4.人胶质母细胞瘤Atg5表达与VM形成和预后密切相关。(1)免疫荧光显示人胶质母细胞瘤组织的干性标记CD133、自噬相关蛋白LC3和VM相关蛋白VE-Cadherin和Laminin B2有共表达的现象,即表达CD133的细胞高表达VM相关蛋白和LC3;WB检测胶质母细胞瘤组织和瘤旁组织,发现肿瘤组织高表达CD133和VM相关蛋白,以及自噬相关蛋白Atg7、Atg5和LC3,而p62表达水平降低,与免疫荧光的结果相一致。(2)通过Atg5+PAS双染95例人胶质母细胞瘤组织,可见有VM的患者比无VM的患者在无疾病进展生存期(progression-free survival,PFS)和总生存期(overall survival,OS)均要短(均P0.001)。(3)免疫组织化学染色人胶质母细胞瘤组织Atg5,示Atg5阳性的患者比Atg5阴性的患者的PFS和OS均要短,均P0.001;并且Atg5表达与VM存在之间呈明确的相关性(r=0.6727,P0.001);(4)免疫组织化学染色p-VEGFR-2,示p-VEGFR-2阳性患者比p-VEGFR-2阴性患者的PFS和OS均要短(分别为P0.001和P0.01);并且p-VEGFR-2表达与Atg5的表达呈明显的相关性(r=0.7743,P0.001);(5)免疫组化染色抗体EGFR、PDGFRA和p53,可将胶质母细胞瘤分为经典样型(classical-like,CL)和神经前样型(proneural-like,PNL)两个亚型,可见PNL亚型的PFS和OS明显优于CL亚型(均为P0.001);并且两种亚型与Atg5的表达呈明显的相关性(P=0.002)。上述结果表明,人胶质母细胞瘤有较高水平VM和自噬相关蛋白的表达,VM是胶质母细胞瘤患者预后不良的重要因素,Atg5和p-VEGFR-2的表达与VM形成呈明显的正相关性,说明自噬可能是通过VEGFR-2的活化调控VM形成及导致临床预后差的重要原因。并且Atg5在预后较差的CL亚型表达率比在预后较好的PNL亚型表达率高,说明Atg5不但是预后不良的指标,也是预测胶质母细胞瘤亚型的重要线索。因此,Atg5可作为今后胶质母细胞瘤治疗的一个重要靶点。综上所述,(1)自噬通过ROS介导VEGFR-2的活化促进VM的形成,该途径是不依赖于VEGF-A的;BEV治疗诱导VM的产生可通过抑制自噬而减少;(2)VM是胶质母细胞瘤预后不良的重要因素,其与Atg5和p-VEGFR-2的表达密切相关;Atg5的表达与胶质母细胞瘤的分子亚型相关。上述的研究结果为胶质母细胞瘤的抗VM治疗提供了新的靶点和理论基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

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本文编号：1520229