ATM基因沉默诱导胶质瘤细胞耐替莫唑胺的分子通路及临床转化研究

发布时间：2018-02-23 18:34

  本文关键词： ATM 化疗耐药 RNA干扰 IFIT1 预后　出处：《福建医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:恶性脑胶质瘤是预后最差的颅内原发肿瘤,烷化剂替莫唑胺(temozolomide,TMZ)化疗是恶性脑胶质瘤综合治疗的重要组成部分,但是目前为止其临床疗效一直不能令人满意,这与胶质瘤对TMZ的化疗耐药密切相关。TMZ化疗引起DNA损伤,启动DNA损伤应答(DNA damage response,DDR),可导致DNA损伤修复,如DNA损伤重要的修复酶O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA Methyltransferase,MGMT)通过对甲基化鸟嘌呤的甲基的转移,修复损伤的DNA,导致肿瘤对TMZ化疗耐药。MGMT的激活依赖于DDR的启动,而毛细血管扩张性共济失调综合症突变基因(ataxia-telangiectasia mutated,ATM)是DDR上游的关键基因,在细胞周期阻滞、细胞凋亡和DNA修复中发挥重要作用,但其在胶质瘤化疗中的作用及机制尚未完全得到阐明。本课题前期研究发现ATM沉默诱导胶质瘤细胞对半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)的TMZ化疗耐药,所以本课题拟通过对胶质瘤细胞中ATM的沉默,体外和体内分别验证ATM在TMZ化疗中的作用,筛选ATM沉默诱导的胶质瘤细胞耐TMZ的分子通路,并进行临床转化研究,以期找到逆转胶质瘤化疗耐药的治疗靶点或预测化疗敏感性和预后的分子标记,达到改善患者预后的目的。方法:(1)运用RNA干扰的方法沉默胶质瘤U87、U251细胞的ATM基因,建立ATM沉默的裸鼠皮下移植瘤模型;MTT法、流式细胞仪技术检测化疗抑制率、细胞周期和细胞凋亡评估ATM沉默后TMZ(IC50)化疗对胶质瘤U87、U251细胞增殖的影响,测量TMZ化疗对裸鼠移植瘤的体积、重量的影响;(2)运用美国Affymetrix公司的人类全基因组寡核苷酸基因芯片检测U251细胞ATM基因沉默的表达谱改变;运用高内涵Cellomics筛选系统筛选由ATM诱导的、功能未完全明确的、与ATM沉默导致的TMZ化疗耐药相关的靶基因;(3)运用RNA干扰的方法沉默所得靶基因;MTT法、流式细胞仪技术检测靶基因沉默对U251细胞TMZ(IC50)化疗的增殖影响;(4)免疫组化法评估磷酸化的ATM(phosphorylated ATM,p-ATM)、所选靶基因、MGMT在胶质母细胞瘤手术标本的表达,分析表达的相关性及与临床预后的关系。结果:(1)获得ATM基因沉默的U87、U251细胞株,两细胞株TMZ(IC50)化疗5天的抑制率分别为21.0±1.7%和29.1±3.0%低于阴性对照组的27.5±3.8%(p=0.008)和36.8±2.0%(p=0.001),细胞凋亡率为2.23±0.05%和15.31±1.71%低于阴性对照组的3.73±0.15%(p=0.000)和21.38±1.13%(p=0.001);获得ATM沉默的胶质瘤U87细胞裸鼠皮下移植瘤模型;TMZ停药后第10天和第13天ATM沉默组细胞增殖倍数(与化疗第一天的肿瘤体积相比)为4.00±3.68和5.72±4.92高于阴性对照组的1.18±0.18和1.22±0.19(p=0.027和0.012),实验结束时ATM沉默组移植瘤重量为0.213±0.246g小于阴性对照组的0.595±0.214g(p=0.002);(2)芯片筛选出U251细胞ATM沉默后差异表达基因726个,按设定条件筛选出进入下游检测的靶基因16个。含有TPR结构的干扰素诱导蛋白1基因(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeat1,IFIT1)沉默的化疗抑制率为8.77%低于阳性对照组的10.29%,为所有筛选靶基因中最低;(3)获得IFIT1基因沉默的胶质瘤U251细胞株;该细胞株TMZ(IC50)化疗5天的抑制率和细胞凋亡率分别为15.3±2.1%和6.61±0.28%低于阴性对照组的29.3±4.9%(p=0.034)和7.43±0.41%(p=0.000);(4)胶质母细胞瘤存在p-ATM和IFIT1基因表达且表达呈正相关(r=0.249,p=0.037),而IFIT1和MGMT的表达呈负相关(r=-0.288,p=0.016);单因素和多因素分析均显示IFIT1高表达患者有较长的无进展生存期(progression-free survival,PFS)(p=0.003和0.017)和总体生存期(overall survival,OS)(p=0.001和0.001),“IFIT1高表达和MGMT低表达”组比“IFIT1低表达和MGMT高表达”组和“两者同时高表达或同时低表达”组的患者有较长的PFS和OS。结论:(1)成功建立ATM基因稳定沉默的胶质瘤U87、U251细胞株和ATM沉默的U87细胞裸鼠皮下移植瘤模型,验证了ATM沉默抑制了胶质瘤细胞凋亡,导致TMZ化疗耐药;(2)在胶质瘤U251细胞中筛选得到与ATM沉默诱导的TMZ化疗耐药相关的、具有诱导细胞凋亡功能的IFIT1基因;(3)成功建立IFIT1稳定沉默的U251细胞株,验证了IFIT1沉默抑制其诱导凋亡的功能,导致U251细胞对TMZ化疗耐药,IFIT1可能成为预示胶质瘤TMZ化疗敏感性的分子标记;(4)胶质母细胞瘤中存在较广泛的IFIT1表达,IFIT1可作为胶质母细胞瘤预后评判的分子标记,联合IFIT1与MGMT对胶质母细胞瘤预后的预测更准确。
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本文编号：1527188