嵌合scFvEGFRvⅢ-CD28-CD3ζ受体修饰T细胞对胶质瘤细胞的杀伤效应

发布时间：2018-03-04 07:15

本文选题：嵌合抗原受体　切入点：慢病毒　出处：《河南大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:脑胶质瘤是成人最常见的原发性恶性脑瘤,尽管其治疗方式有多种,但最大范围的手术切除、放疗和化疗都未能达到满意疗效。这些治疗方式因对正常脑组织和其他组织具有非特异性损伤而受到了限制。传统治疗方式的缺点刺激了新疗法的发展,相比较而言,免疫治疗是一个精确的疗法,能够有效的靶向神经系统肿瘤,减少脱靶效应对正常脑组织导致的间接损伤。大量临床证据已展示免疫治疗在B细胞恶性肿瘤和实体肿瘤等治疗上所具有的潜力。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)是一种久经考验的方法,它将特异性抗体的可变区与T细胞的功能结合,表达于T淋巴细胞表面介导其抗原特异性激活,CAR在肾细胞癌、神经母细胞瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病等恶性疾病的治疗中表现出了非凡的潜能,在过去的20多年里,有关CAR的技术发展极其迅速,CAR也已经从实验室转化到胶质瘤的临床治疗中。表皮生长因子受体III型突变体(epidermal growth factor receper variant III,EGFRv III)表达于脑胶质瘤和其他恶性肿瘤的表面而在正常组织不表达,是靶向治疗的最佳靶点。本实验构建嵌合抗原受体sc Fv EGFRv III-CD28-CD3ζ,利用sc Fv EGFRv III实现靶向免疫治疗胶质瘤细胞,共刺激分子CD28促进T细胞的扩增,延长T细胞寿命,CD3ζ激活T细胞毒性反应。以慢病毒为载体介导EGFRv III/CD28-CAR重定向T细胞,使T细胞特异性识别并杀伤EGFRv III阳性脑胶质瘤细胞(EGFRv III+U87MG),是胶质瘤免疫治疗的新思路。目的:构建第二代慢病毒表达载体p CDH-CD28-CAR;探讨EGFRv III/CD28-CAR+T细胞对EGFRv III+U87MG细胞的体外生物学效应。方法:第一部分(1)委托公司合成基因片段Hinge-TM-CD28-CD3ζ;将Hinge-TM-CD28-CD3ζ克隆至慢病毒表达载体p CDH-EF1-MCS-T2A-cop GFP的Bam HI和Eco RI位点,获得的载体被命名为p CDH-CD28-CD3ζ;PCR扩增p CR2.1TOPO中的sc Fv EGFRv III基因序列;将sc Fv EGFRv III克隆至p CDH-CD28-CD3ζ的Eco RI位点,采用菌落PCR方法判断sc Fv EGFRv III与p CDH-CD28-CD3ζ的连接是否正确,最后DNA测序鉴定各碱基是否正确,新载体命名为p CDH-CD28-CAR。(2)通过磷酸钙沉淀法将三质粒(包膜蛋白质粒p VSVG、包装质粒p Del8.9和p CDH-CD28-CAR)共转染293T细胞包装慢病毒;使用蔗糖超速离心沉淀法浓缩慢病毒上清液;使用有限稀释法测定慢病毒(LV EGFRv III/CD28-CAR)的滴度。第二部分(1)慢病毒LV EGFRv III/CD28-CAR感染运用免疫磁珠技术分离、激活、扩增的健康供着外周血CD3+T细胞。(2)运用Western blot和流式细胞术检测EGFRv III/CD28-CAR在T细胞的表达情况,ELISA法检测效靶共培养上清细胞因子IFN-γ的分泌水平,51Cr释放法检测EGFRv III/CD28-CAR+T细胞的杀伤效应。结果:第一部分(1)DNA测序鉴定CAR的sc Fv EGFRv III、Hinge、TM、CD28和CD3ζ的序列和连接正确,成功构建了慢病毒表达载体p CDH-CD28-CAR;(2)包装的慢病毒LV-EGFRv III/CD28-CAR滴度高达1.2x108 TU/ml,LV-EGFRv III/CD28-CAR感染T细胞的效率高达73.9%。第二部分体外实验显示效靶细胞共培养上清中可检测到明显的IFN-γ分泌,EGFRv III/CD28-CAR+T细胞可以特异性的杀伤EGFRv III+U87细胞,EGFRv III/CD28-CAR+T细胞发挥杀伤效应和分泌IFN-γ均依赖U87MG细胞EGFRv III的表达。结论:体外实验证实了EGFRv III/CD28-CAR+T细胞对EGFRv III+U87MG细胞的特异性杀伤作用,为下一步体内实验打下了基础。
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【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.41

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