低氧促进胶质母细胞瘤自噬和侵袭迁移过程中相关microRNAs的作用机制研究

发布时间：2018-03-06 03:08

  本文选题：胶质瘤　切入点：低氧肿瘤微环境　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景：人脑胶质瘤(Glioma)是中枢神经系统最常见的颅内原发恶性肿瘤,在所有颅内原发性肿瘤中占到70%左右,其中约50%以上为恶性程度最高的胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme, GBM; WHO IV级)。手术及放化疗等主要的传统治疗方法治愈率低,肿瘤复发率高,患者预后差。近年来,虽然显微手术、新放化疗策略、抗侵袭疗法、抗血管生成疗法和多种基因免疫疗法在人脑胶质瘤等多种恶性肿瘤的治疗研究中取得了长足进步。但由于人脑胶质瘤具有浸润性生长、化疗耐药性、高侵袭性、血管生成拟态以及特殊的免疫抑制性微环境等恶性特征,上述疗法在所有临床实验中均未取得令人满意的效果,患者预后尚无明显改善,中位生存时间仅约12个月,5年生存率不足5%。因此,人们寄希望于对胶质瘤微环境以及细胞恶性行为能力改变机制的深入揭示。其中低氧是实体肿瘤微环境的重要特征之一,参与并调控了肿瘤增殖、侵袭、血管新生及耐药性等一系列变化。因此揭示低氧促进人脑胶质瘤细胞恶性生长、产生耐药性以及侵袭迁移能力的内在机制,并筛选其调控的关键靶点,将为改善胶质瘤的综合疗法提供新的策略。肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)是一个具有物理低氧的多因子、多细胞的复杂环境。胶质瘤作为一种典型的实体肿瘤,存在广泛的低氧区域。研究证实,虽然胶质瘤血供较为丰富,但由于增殖代谢旺盛以及血管结构功能异常,各WHO级别的人脑胶质瘤仍存在不同程度的低氧微环境。低级别胶质瘤(WHOⅠ级和Ⅱ级)低氧程度相对较低,其肿瘤内低氧水平约为10%(氧分压)。而高级别胶质瘤低氧水平更为显著,WHO Ⅲ级胶质瘤的氧分压约为2.5～10%,WHOⅣ级胶质瘤的氧分压甚至不足1%。因此,这种强烈的低氧分压微环境作为重要的始动因素之一,显著的影响着胶质瘤细胞的生物学行为,并导致了其对放化疗耐受性的提高,以及增值、侵袭和迁移等能力的改变。同时,严重的低氧微环境也显著改变了微环境中除胶质瘤细胞外的其他各种细胞组分以及所分泌细胞因子的特征。microRNAs (miRs)是一类长约19-22nt的内源性非编码RNA,通过与靶基因3’端非翻译区(3'-UTR)特异性结合并导致靶基因mRNA降解或抑制其翻译,在转录后水平对基因进行调控,在细胞增殖、凋亡、运动等一系列生物学过程中发挥着重要作用。严重的低氧微环境可以显著影响胶质母细胞瘤中多种miRs的表达,并能通过调控相应下游靶基因发挥重要的作用。其中与肿瘤细胞自噬和细胞运动相关的多个miRs以及其上下游复杂的分子调控机制,可能参与了低氧下胶质母细胞瘤细胞的恶性增殖、耐药性的产生以及侵袭迁移的增强。自噬(Autophagy)是存在于真核生物中一种高度保守的代谢过程：通过回收细胞内受损、变性或衰老的蛋白质和细胞器来自我消化,满足细胞的自身代谢需要和细胞器的再更新。这种回收能量的特殊生存机制在维持细胞正常运转、自我修复、逃避恶劣环境(如饥饿、低氧和毒物药物等)等方面发挥着重要作用。而自噬作为一种新的细胞死亡机制,与凋亡之间存在密切关系,即细胞可在一定程度上通过增强自噬避免凋亡,以帮助细胞抵御恶劣环境。胶质母细胞瘤中存在着广泛的自噬激活现象,显著提高了其对低氧微环境和化疗药物的耐受能力。研究证实低氧是诱导的胶质母细胞瘤自噬增强的重要因素之一,但其具体调控机制仍不清楚。此外,低氧可以显著上调胶质母细胞瘤白细胞介素6 (Interleukin-6,IL-6)的分泌,进而促进肿瘤细胞的增殖和侵袭迁移等,但IL-6是否参与了低氧诱导的自噬上调以及相关miRs调控网络的作用尚无报道。除了耐药性,人脑胶质母细胞瘤的高侵袭特性也是导致其易复发和致死亡的重要因素之一。侵袭与迁移是肿瘤的重要恶性表型,这一特性受肿瘤微环境中多种因素的调控。细胞极性(Cell Polarity)与肿瘤侵袭转移密切相关,并决定细胞侵袭和迁移的方式。研究发现,低氧可诱导胶质母细胞瘤细胞极性的产生和增强并能促进细胞的侵袭和迁移,而低氧可显著影响调控肿瘤细胞极性的关键分子Rho家族GTP酶的活性。该家族的主要成员包括Rac、RhoA和Cdc42,三者相互配合并顺序激活才能形成有效的细胞迁移,抑制RhoGTP酶通路的活性可导致肿瘤细胞极化和侵袭迁移障碍。越来越多研究证实miRs作为一类重要细胞内调控分子,参与了对细胞运动能力的调节。而低氧诱导的miRs促进胶质母细胞瘤侵袭和迁移的关键调控靶点尚不明确,需要进一步深入研究。本课题分别从低氧诱导的胶质母细胞瘤自噬和侵袭迁移增强等方面,深入系统的探讨了相关的关键调控miRs及其具体分子作用机制。首先,利用基因芯片检测并筛选出了多个调控低氧下胶质母细胞瘤自噬和侵袭迁移的关键miRs靶点；然后,证实了IL-6及其下游miR-155-3p在低氧诱导的胶质母细胞瘤自噬上调中的关键作用,并对抗IL-6受体单克隆抗体(Tocilizumab注射液)的化疗辅助疗效进行了系统评价；最后,深入研究了低氧上调的miR-584-3p在调控胶质母细胞瘤侵袭迁移中的关键作用和具体分子机制。本课题为人脑胶质母细胞瘤的治疗提供了多个针对关键miRs的新靶点,具有重要的理论价值和广阔的应用前景。第一部分低氧下胶质母细胞瘤全基因表达谱和全microRNAs表达谱芯片检测和潜在自噬与侵袭迁移miRs靶点筛选1.1目的：(1)检测低氧对胶质母细胞瘤全基因组表达谱和全microRNAs表达谱的影响,进而联合分析两组芯片数据并筛选与低氧下自噬增强和侵袭迁移变化可能相关的miRs。(2)进一步实验室验证并明确能够显著影响低氧下胶质母细胞瘤细胞自噬和侵袭迁移的miRs。1.2方法：(1)低氧处理、RNA提取和基因芯片检测将低氧处理24h的U251细胞与常氧组对照分别提取总mRNA和总microRNA,通过全基因表达谱和全microRNA表达谱的检测,获取详细结果分析报告和原始数据。(2)两组芯片数据的联合分析和靶点预测筛选经检测芯片数据及样本同质性均较好,使用火山图(Volcano Plot)法筛选出低氧条件下胶质母细胞瘤中表达量变化具有显著性差异的基因和miR s。然后,结合全基因组表达谱芯片报告中的通路分析(P athway Analysis)和GO分析(Gene Ontology Project Analysis)结果以及大量文献阅读,将筛选出的差异性基因和miRs进行关联分析,并进行功能分类,进一步缩小研究范围,找出最有可能调控胶质母细胞瘤自噬和侵袭迁移的miRs。(3)实验室验证所筛选靶点首先,使用多种胶质母细胞瘤细胞系(U251、T98G、U87和A172)进行低氧培养,对筛选出的低氧下变化显著的部分miRs进行实时定量PCR验证。然后,向低氧培养的U251细胞系中瞬时转染相应的microRNA inhibitor和mimics,对通过验证的miRs进行敲除和过表达,分别利用Western blot法、实时定量PCR法、和Transwell法检测上述U251细胞内自噬标记蛋白LC3B分子的表达水平、自噬相关miRs的表达水平、以及迁移能力变化。1.3结果：(1)低氧对胶质母细胞瘤全基因组表达谱和全microRNAs表达量的影响芯片共检测已知基因位点25485个,低氧下上调基因3104个,下调240个；检测已知microRNA位点2137个,低氧下上调157个,下调85个。低氧条件下胶质母细胞瘤U251细胞系的多种mRNA和miR表达量发生了显著改变。(2)联合分析两组芯片数据并筛选与低氧下自噬增强和侵袭迁移变化可能相关的miRs箱图、散点图及聚类分析结果均显示该芯片数据质量可靠,而火山图筛选出2倍以上变化的显著性差异表达的基因和miRs数目明显减少：其中基因有304个,其中上调242个,下调62个；而miRs有84个,其中上调67个,下调17个。然后根据变化倍数对上述靶点进行由大到小排序。对上述差异表达的基因进行Pathway分析发现,富集值较高的通路共6条,其中上调5条,下调1条。而GO分析筛选出上调GO条目218条,下调GO条目87条。结合miRs芯片结果进行联合分析并进行大量文献查阅,按照自噬和侵袭迁移两大功能进行分类,分别筛选出了最有可能调控胶质母细胞瘤自噬的5个miRs以及10个侵袭迁移相关的miRs。(3)进一步实验室验证并明确能够显著影响低氧下胶质母细胞瘤细胞自噬和侵袭迁移的miRs经过进一步低氧胶质母细胞瘤细胞系(U251、T98G、U87和A172)的实时定量PCR验证,最终确定了低氧下表达最具显著差异性的5个miRs(自噬相关的miR-155-3p和miR-224-3p,以及侵袭迁移相关的miR-210、miR-573-5p和miR-584-3p)。通过对低氧培养下5种miRs的敲除和过表达瞬时转染U251细胞系的进一步分子生物学和细胞学实验发现,低氧上调的miR-155-3p和下调的miR-224均可显著影响细胞自噬水平,而侵袭迁移相关的3个上调miRs中仅miR-584-3p能显著改变U251细胞系的迁移能力。此外,IL-6同样可以刺激U251细胞显著上调miR-155-3p。1.4结论：(1)低氧条件可以显著改变胶质母细胞瘤U251细胞的多种基因和miRs的表达水平,其中低氧上调的miR-155-3p和下调的miR-224能显著影响U251细胞自噬水平,而miR-584-3p参与了低氧调控U251细胞系的迁移能力的过程。(2)基因芯片是筛选分子调控靶点的有效工具。1.5创新点：肿瘤低氧微环境是胶质瘤等实体肿瘤最重要的恶性表型之一,本课题通过使用全基因组表达谱芯片对体外低氧培养的胶质母细胞瘤细胞系进行检测,在国际上首次发现了多个与胶质瘤低氧相关的microRNAs分子,并阐明了这些低氧相关的microRNAs的促肿瘤机制(miR-155-3p、miR-224-3p和miR-584-3p的功能均为国际上的首次报道)。第二部分低氧诱导的IL-6和miR-155-3p上调对胶质母细胞瘤自噬水平的影响和机制研究及Tocilizumab的辅助疗效研究2.1目的：(1)在各级别人脑胶质瘤组织标本中检测HIF-1α、IL-6、LC3B以及IL-6效应分子STAT3和p-STAT3的表达并分析其相关性。(2)在体外实验中,利用细胞系和原代胶质瘤细胞,研究低氧对胶质母细胞瘤细胞自噬水平和IL-6的分泌的促进作用,以及外源性和内源性IL-6对胶质母细胞瘤细胞自噬水平的促进作用及相关通路；研究miR-155-3p及其下游通路在低氧诱导IL-6促进自噬过程中的关键作用；研究低氧下IL-6介导的胶质母细胞瘤自噬改变对凋亡水平的影响。(3)在体内实验中,研究IL-6和miR-155-3p敲除对低氧诱导胶质母细胞瘤自噬水平变化和肿瘤生长的影响,并评价IL-6受体单抗Tocilizumab单独应用和与替莫唑胺(TMZ)联用对低氧诱导胶质母细胞瘤自噬水平变化和肿瘤生长的影响及疗效。2.2方法：(1)低氧细胞培养及刺激、RNA和蛋白水平检测对胶质母细胞瘤细胞系和原代胶质瘤细胞进行低氧培养,同时利用外源性IL-6、IL-6阻断抗体、STAT3抑制剂、3-MA、BAF等进行相关刺激,并提取总mRNA和总microRNA用于各相关分子的实时定量PCR检测,或提取总蛋白用于各相关分子的western blot检测。(2)体外实验中的自噬相关检测自噬强度反应指标：倒置荧光显微镜检测带荧光标记自噬蛋白(GFP-LC3B)的U251和T98G细胞中LC3B的荧光强度；Western blot法检测细胞中自噬标记蛋白LC3B-I向Ⅱ的转化和P62的降解；透射电镜法(金标准)检测细胞内自噬小体；3-MA对自噬的抑制和BAF对自噬流的阻断等。(3)细胞转染及荧光素酶报告基因实验分别使用GFP-LC3B质粒、IL-6小干扰RNA、CREB3小干扰RNA、miR-155-3p inhibitor、miR-155-3p mimics、STAT3结合区突变荧光素酶报告基因质粒、miR-155-3p种子序列结合区突变荧光素酶报告基因质粒对U251和T98G细胞进行瞬时转染,用于自噬监测、敲除、过表达、以及荧光素酶报告基因检测。利用IL-6小干扰RNA慢病毒、miR-155-3p inhibitor'慢病毒和miR negative control慢病毒对U251细胞进行稳定转染,用于体内实验皮下成瘤。(4) ELISA检测取不同处理组肿瘤细胞培养上清或动物实验荷瘤小鼠不同治疗组血清进行IL-6的ELISA检测。(5)免疫组织化学染色和免疫荧光染色通过免疫组织化学染色检测：101例各级别人脑胶质瘤组织标本中HIF-1α、 IL-6.LC3B以及IL-6效应分子STAT3和p-STAT3的表达；5例超薄连续切片的高级别胶质母细胞瘤标本中HIF-1α、IL-6、LC3B、STAT3和p-STAT3的共定位现象；各体内实验的皮下肿瘤中HIF-1α、IL-6、LC3B、STAT3、p-STAT3、Ki-67、 Cleaved Caspase-3的表达水平。通过免疫荧光染色检测：5例高级别胶质瘤组织标本切片中IL-6与各类肿瘤低氧微环境中的免疫细胞特异性标记的共定位效应,确定胶质母细胞瘤中IL-6的具体来源分布；以及5例人脑高级别胶质瘤冰冻切片中C REB3.ATG5和LC3免疫荧光共定位效应。(6)细胞活力和凋亡相关检测体外实验中分别使用CCK-8法、以及PI-AnnexinV流式细胞染色法、TUNEL免疫荧光染色法、凋亡相关蛋白caspase3和PARP Western blot法检测常氧和低氧条件下阻断IL-6对胶质母细胞瘤细胞株U251细胞活力和凋亡水平的影响。体内试验中使用免疫组化染色法检测Ki-67和Cleaved Caspase-3的表达水平来反映增殖和凋亡。(7)人脑胶质瘤裸鼠体内皮下成瘤实验通过皮下成瘤体内实验分别研究IL-6和miR-155-3p敲除、IL-6受体单抗Tocilizumab.以及Tocilizumab与替莫唑胺(TMZ)联用对低氧诱导胶质母细胞瘤自噬水平变化(免疫组织化学染色)和肿瘤生长(肿瘤体积测量)的影响。2.3结果：2.3.1人脑胶质瘤组织标本中HIF-1α、IL-6、p-STAT3、LC3B的表达与胶质瘤级别呈正相关101例胶质瘤患者组织标本的免疫组织化学染色结果显示,HIF-1α、IL-6.p-STAT3口LC3B的表达均随胶质瘤级别升高而上调,STAT3表达相对稳定。HIF-1α、IL-6、LC3B、p-STAT3口WHO分级之间均存在着较强的两两正相关性；高级别胶质瘤标本中HIF-1α、IL-6、LC3B、STAT3和p-STAT3存在明显的共定位效应,且围绕血管周边低氧区呈环形分布；高级别胶质瘤标本的免疫荧光共定位染色发现约80%的IL-6来源于胶质瘤细胞的自分泌和旁分泌,各种IL-6分泌型免疫细胞仅占20%左右。2.3.2低氧显著上调胶质母细胞瘤细胞的自噬水平和IL-6分泌GFP-LC3B荧光结果和Western blot结果均显示U251和T98G细胞的自噬水平在低氧下显著上调,且3-MA能抑制该自噬上调,而BAF自噬流阻断实验证实低氧下U251和T98G细胞自噬流通畅。ELISA法检测发现U251和T98G细胞低氧下IL-6的分泌显著增加。2.3.3外源性和内源性IL-6均能通过p-STAT3通路显著上调胶质母细胞瘤细胞自噬水平GFP-LC3B免疫荧光、western blot和透射电镜结果均发现常氧条件下外源性IL-6处理的U251和T98G细胞自噬水平均显著上调；使用抗体阻断或小干扰RNA敲除IL-6能够显著抑制IL-6和低氧诱导的自噬；GFP-LC3B免疫荧光和western blot结果还发现IL-6通过上调STAT3的磷酸化水平来激活自噬,阻断IL-6能够显著降低STAT3的磷酸化水平和自噬水平。2.3.4低氧诱导的IL-6/p-STAT3通路通过上调miR-155-3p的表达来促进胶质母细胞瘤细胞自噬水平实时定量PCR结果显示低氧下miR-155-3p表达量显著上调并具有时间依赖性,且外源性IL-6也能够促进U251细胞中miR-155-3p的表达,而IL-6阻断剂处理的U251细胞中miR-155-3p的表达量显著下调；p-STAT3抑制剂处理的U251和T98G细胞中miR-155-3p的表达量显著下调；进一步通过荧光素酶报告基因实验证实,p-STAT3能够对miR-155-3p的表达进行直接调控；GFP-LC3B免疫荧光和western blot结果均发现,在常氧和低氧条件下使用miR-155-3p inhibitor进行miR的敲除能够显著下调U251的自噬水平,且miR-155-3p inhibitor能够阻断IL-6对自噬的促进作用；而使用miR-155-3p mimics进行miR的过表达能够显著上调U251的自噬水平,且miR-155-3p mimics能够显著提高IL-6阻断抗体和IL-6小干扰RNA处理U251细胞的自噬水平。2.3.5 miR-155-3p调控胶质母细胞瘤细胞自噬水平的具体分子靶点和机制以及低氧诱导自噬的完整信号通路miRbase的miR-155-3p直接结合靶点预测结果显示,CREBRF是miR-155-3p的最佳靶分子,3’UTR区域中存在三个结合力较高的种子序列；荧光素酶报告基因结果证实CREBRF为miR-155-3p的直接靶点；Western blot验证发现miR-155-3p过表达能显著下调CREBRF蛋白水平,并上调CREBRF下游负向调控靶分子CREB3的表达；敲除U251和T98G细胞中的CREB3能显著抑制自噬,且自噬相关蛋白ATG5为CREB3促进自噬现象的效应分子；通过对人脑高级别胶质瘤冰冻切片进行CREB3、ATG5和LC3免疫荧光共定位染色发现,三者具有显著的共定位关系。综上所述,胶质母细胞瘤中“低氧/IL-6/p-STAT3/miR-155-3p/CREBRF/ CREB3/ATG5/LC3B/自噬”这一完整信号通路的体外实验验证完成(同时使用原代胶质母细胞瘤进行了重复验证)。2.3.6低氧诱导的IL-6通过上调胶质母细胞瘤自噬水平抑制其凋亡CCK-8法检测发现低氧下阻断IL-6能降低U251的细胞活力；而通过PI-AnnexinV流式细胞染色法、TUNEL法和Western blot法检测均发现低氧条件下阻断IL-6能够显著提高U251细胞的凋亡水平。2.3.7体内实验中敲除IL-6和miR-155-3p能抑制低氧诱导的胶质母细胞瘤自噬并抑制肿瘤生长人胶质瘤荷瘤裸鼠异位模型结果显示IL-6小干扰RNA和miR-155-3p inhibitor均可抑制裸鼠皮下肿瘤的生长；免疫组化法结果显示IL-6敲除的皮下肿瘤中IL-6、LC3B、p-STAT3和Ki-67显著下降,Cleaved Caspase-3的水平升高,而miR-155-3p敲除的皮下肿瘤中IL-6未受显著影响,但下游LC3B、p-STAT3和Ki-67显著下降,Cleaved Caspase-3的水平升高。2.3.8体内实验中IL-6单抗Tocilizumab通过阻断胶质母细胞瘤自噬通路抑制肿瘤生长Tocilizumab能够抑制胶质母细胞瘤的生长,并能够显著降低荷瘤小鼠血液内的IL-6水平(p0.05)；免疫组织化学结果显示Tocilizumab治疗组的皮下肿瘤中IL-6、LC3B、p-STAT3、Ki-67水平显著下降,Cleaved Caspase-3的表达水平显著上调。2.3.9体内实验证实IL-6单抗Tocilizumab与替莫唑胺(TMZ)联用可提高后者疗效Tocilizumab注射液和TMZ均可显著抑制胶质母细胞瘤生长,Tocilizumab能够显著促进TMZ的疗效(p0.05)；免疫组织化学染色结果显示,与前面体内实验结果一致Tocilizumab能显著下调皮下肿瘤中IL-6、LC3B、p-STAT3、和Ki-67水平,并上调Cleaved Caspase-3的表达水平。TMZ治疗组IL-6、LC3B、p-STAT3水平显著上调,而Tocilizumab能够显著抑制TMZ对IL-6、LC3B、p-STAT3的上调,并进一步上调Cleaved Caspase-3的表达水平。2.4结论：(1)各级别人脑胶质瘤组织标本中HIF-1α、IL-6、LC3B、p-STAT3和WHO分级之间存在着较强的正相关性,其中高级别胶质母细胞瘤中IL-6来源以胶质瘤细胞自身为主,其它多种免疫间质细胞也有部分分泌。首次证实高级别胶质母细胞瘤血管周环形低氧区中HIF-1α、IL-6、LC3B、STAT3和p-STAT3存在明显的共定位效应。(2)体外实验结果证实,低氧条件下胶质母细胞瘤自噬上调是通过“低氧/IL-6/p-STAT3/miR-155-3p/CREBRF/CREB3/ATG5/LC3B/自噬”这一全新完整信号通路实现的,揭示了IL-6在该过程中重要的始动作用。通过IL-6阻断抗体抑制IL-6的促自噬作用能够促进胶质母细胞瘤凋亡,提示了IL-6抗体潜在的治疗价值。(3)通过进一步体内实验证实,IL-6和miR-155-3p敲除可显著降低低氧诱导胶质母细胞瘤自噬并抑制肿瘤生长,而IL-6单抗Tocilizumab也能够降低低氧诱导胶质母细胞瘤自噬,促进凋亡,抑制肿瘤生长,并显著提高了替莫唑胺(TMZ)的抑瘤疗效。这些结果为抗关节炎新药Tocilizumab在胶质母细胞瘤辅助治疗中的临床应用提供了重要的依据。2.5创新点：(1)在国际上首次提出并证实了IL-6是介导低氧下胶质母细胞瘤自噬的关键启动因子,并首次报道了这种IL-6促进实体肿瘤恶性进展的新机制。(2)在国际上首次发现并报道了IL-6促进低氧肿瘤细胞自噬的完整分子通路(低氧/IL-6/p-STAT3/miR-155-3p/CREBRF/CREB3/ATG5/LC3B/自噬),其中p-STAT3对miR-155-3p的直接调控机制、miR-155-3p对CREBRF的直接调控机制、和CREB3对ATG5调控机制均为国际上的首次报道,均具有非常强的创新性。(3)在国际上首次提出了处于肿瘤血管周围低氧区中的胶质瘤细胞通过上调IL-6自分泌和旁分泌提高自身自噬水平,从而抑制凋亡,促进肿瘤恶性进展的新假说,并加以阐明。(4)在国际上首次利用IL-6单克隆抗体Tocilizumab进行胶质瘤辅助治疗的动物实验,发现了Tocilizumab注射液在治疗风湿性关节炎之外的抗胶质瘤作用,并首次证实了Tocilizumab通过阻断IL-6诱导的自噬并促进凋亡的抗胶质瘤作用机制。(5)更重要的是,由于现有临床上唯一批准的抗胶质瘤化疗药物替莫唑胺(TMZ)存在极高的耐药率,而这种耐药率的产生与替莫唑胺诱导的胶质瘤细胞保护性自噬有密切关系,我们首次发现Tocilizumab与替莫唑胺联合应用能显著抑制这种自噬依赖的耐药性,大大提高替莫唑胺的抑瘤疗效,具有重要的临床应用价值和潜在的社会经济效益。第三部分miR-584-3p对低氧条件下人脑胶质母细胞瘤的侵袭和迁移能力的影响及机制研究3.1目的：(1)检测各WHO级别人脑胶质瘤组织标本中miR-584-3p的表达水平与其靶分子ROCK1的表达相关性,并结合胶质瘤患者的病例随访结局研究miR-584-3p的表达水平与术后生存期的关系。(2)在体外实验中研究miR-584-3p对低氧下胶质母细胞瘤细胞侵袭迁移能力、细胞骨架的影响及其直接靶点和分子机制。(3)通过体内实验研究miR-584-3p对胶质母细胞瘤侵袭迁移能力的影响。3.2方法：(1)低氧细胞培养及刺激、RNA和蛋白水平检测对U251和U87细胞进行低氧处理,结合各种转染或ROCK1抑制剂Y27632等相关刺激后,提取总mRNA和总microRNA用于各相关分子的实时定量PCR检测,或提取总蛋白用于各相关分子的western blot检测。(2)侵袭迁移相关检测和细胞骨架荧光染色通过使用常氧和低氧条件下的12h划痕实验、24h Transwell迁移实验、和24h Matrigel基质胶侵袭迁移实验检测各实验组U251和U87细胞迁移侵袭能力的变化。使用罗丹明标记的鬼笔环肽对细胞爬片上的细胞进行细胞骨架免疫荧光染色,观察细胞骨架中张力纤维的改变。(3)细胞转染及荧光素酶报告基因实验分别使用miR-584-3p inhibitor、miR-584-3p mimics、miR-584-5p inhibitor、miR-584-5p mimics、ROCK1、干扰RNA. miR-584-3p种子序列结合区突变荧光素酶报告基因质粒对U251和U87细胞进行瞬时转染,用于敲除、过表达、以及荧光素酶报告基因检测。利用miR-584-3p inhibitor、miR-584-3p mimics'慢病毒和miR negative control慢病毒对U87细胞进行稳定转染,用于体内实验颅内原位成瘤。(4)组织标本中的免疫组织化学染色与实时定量PCR检测选取26例各级别人脑胶质瘤组织标本,通过免疫组织化学染色检测组织标本中ROCK1的表达,同时提取总RNA后使用实时定量PCR法检测标本中miR-584-3p的表达水平,并将结果进行相关分析。(5)生存分析对26例胶质瘤患者进行随访,随访结局为患者是否死亡并记录死亡时间。根据患者手术标本中的miR-584-3p的表达水平,分为高表达组和低表达组,并进行Kaplan-Meier生存分析。(6)颅内原位成瘤实验利用稳定转染的U87细胞建立人胶质瘤荷瘤裸鼠颅内原位模型(立体定向仪接种),随机分为miR-584-3p mimics、miR-584-3p inhibitor和negative control三组。通过磁共振定期测量颅内肿瘤的大小,观察miR-584-3p对胶质母细胞瘤生长的影响。同时通过HE染色法检测颅内肿瘤边界和浸润情况,反应胶质瘤的侵袭能力变化。并使用免疫组织化学法检测miR-584-3p对胶质母细胞瘤中ROCK1的影响。3.3结果：3.3.1低氧能够上调人脑胶质母细胞瘤细胞中miR-584-3p表达水平实时定量PCR结果表明低氧下U251和U87细胞中的miR-584-3p显著上调,并在24h左右达到高峰。3.3.2人脑胶质瘤组织标本中miR-584-3p的表达水平随WHO级别而升高实时定量PCR检测26例不同WHO级别的新鲜人脑胶质瘤组织标本发现,miR-584-3p的表达水平与级别有关,高级别胶质瘤患者(WHO Ⅲ口Ⅳ级)的miR-584-3p的表达水平显著高于低级别胶质瘤患者(WHO Ⅰ和Ⅱ级)(p0.05)。高级别胶质瘤患者(WHO Ⅲ口Ⅳ级)的miR-584-3p的表达水平(4.4±3.9)组内差异较大。3.3.3高表达miR-584-3p的高级别胶质瘤患者术后生存期显著延长高级别胶质瘤患者(WHO Ⅲ和Ⅳ级)术后一年生存率为53.3%,其中miR-584-3p高表达组的高级别胶质瘤患者术后1年生存率为75%,而miR-584-3 p低表达组的高级别胶质瘤患者术后1年生存率仅为28.6%(p=0.03)。3.3.4 miR-584-3p敲除能够显著促进低氧下胶质母细胞瘤细胞侵袭迁移常氧和低氧条件下的12h划痕实验和24h Transwell迁移实验发现miR-584-3p inhibitor瞬时转染能够显著增强U251和U87细胞的迁移能力；Matrigel基质胶侵袭迁移实验也发现miR-584-3p inhibitor瞬时转染能够显著增强U251和U87细胞的侵袭能力。3.3.5miR-584-3p过表达能显著抑制低氧下胶质母细胞瘤细胞侵袭迁移常氧和低氧条件下的12h划痕实验和24h Transwell迁移实验检测发现miR-584-3p mimics瞬时转染能够显著抑制U251和U87细胞的迁移能力；Matrigel基质胶侵袭迁移实验也发现miR-584-3p mimics瞬时转染能显著抑制U251口U87细胞的侵袭能力。3.3.6 miR-584-3 p通过调控低氧下胶质母细胞瘤细胞骨架重构抑制侵袭迁移细胞骨架荧光染色发现,低氧下的U251细胞形态明显伸长,极性增加,细胞骨架中张力纤维呈明显的束状聚集并贯穿与细胞的长轴,而miR-584-3p敲除能够显著增强U251细胞的极性和张力纤维的束状聚集；miR-584-3p过表达能够消除常氧和低氧下的U251细胞极性,细胞呈圆形形态,细胞骨架中张力纤维束状聚集现象消失,并高度聚集于细胞皮层下。3.3.7 miR-584-3p通过直接靶向ROCK1调控低氧下胶质母细胞瘤侵袭迁移能力根据细胞骨架张力纤维变化,检测其关键调控分子ROCK1发现,miR-584-3p能够显著改变ROCK1的表达；而划痕实验和Transwell实验均发现ROCK1抑制剂Y27632和ROCK1小干扰RNA均能够阻断miR-584-3p对胶质母细胞瘤侵袭迁移能力调控作用；荧光素酶报告基因实验结果证实,ROCK1为miR-584-3p的直接靶点,并通过Western blot进行了验证。3.3.8各WHO级别人脑胶质瘤组织标本中miR-584-3p与ROCK1的表达呈负相关26例人脑胶质瘤组织标本的ROCK1免疫组织化学染色结果显示,ROCK1的表达水平与miR-584-3p的表达水平呈负相关,Spearman相关系数为-0.7,p0.01。3.3.9体内实验中过表达miR-584-3p能显著抑制胶质母细胞瘤侵袭迁移能力并延长生存期人胶质瘤荷瘤裸鼠颅内原位模型研究发现miR-584-3p过表达组颅内肿瘤边界相对清晰和浸润较少,胶质瘤的侵袭能力受到抑制,而miR-584-3p敲除组颅内肿瘤边界不清和浸润较为明显,胶质瘤的侵袭能力显著增强；ROCK1免疫组织化学染色发现miR-584-3p能够抑制体内实验的胶质母细胞瘤中ROCK1的表达；此外,miR-584-3p过表达组荷瘤小鼠生存期显著延长,而敲除组显著缩短。3.4结论：(1)虽然高级别胶质瘤患者(WHO III和Ⅳ级)的miR-584-3p的表达水平显著高于低级别胶质瘤患者(WHO Ⅰ和Ⅱ级),但组内差异性大。其中,miR-584-3p高表达的高级别胶质瘤患者术后1年生存率较低表达患者显著提高,提示miR-584-3p具有抑癌作用,并能够作为胶质母细胞瘤预后的标记。低氧诱导人脑胶质母细胞瘤细胞中miR-584-3p的表达升高为反应性保护性上调。(2)体外实验和体内实验均证实,miR-584-3p能够通过直接靶向抑制ROCK1依赖的细胞骨架重构,从而显著抑制低氧下胶质母细胞瘤细胞的侵袭迁移能力,减少肿瘤浸润性生长,并限制肿瘤大小,延长生存期。提示miR-584-3p可以作为胶质母细胞瘤抗侵袭治疗的潜在干预靶点,具有重要的学术意义和应用价值。3.5创新点：(1)在国际上首次发现了并报道了miR-584-3p的生物学功能,即抑制低氧下胶质母细胞瘤细胞迁移和侵袭的作用,并证实了其直接靶点之一是,ROCK1。(2)在国际上首次发现并报道了人脑胶质瘤患者标本中miR-584-3p的表达水平与预后生存期的关系,提供了miR-584-3p是一个重要的抑癌基因,也是一个良好的预后预测标记的直接证据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.4
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本文编号：1573054