硫化氢调节大鼠不同脑区神经元兴奋性及其在癫痫发作和摄食调控中的作用

发布时间：2018-03-10 09:49

本文选题：硫化氢　切入点：AMPAR　出处：《华中科技大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分硫化氢对大鼠海马CA1脑区AMPA受体膜转运的作用及机制目的：硫化氢是一种气体信号分子,参与对神经突触可塑性传递和学习记忆的调节。但是关于硫化氢调节突触可塑性的分子机制,目前尚未研究清楚。本课题即从硫化氢对海马脑区AMPA受体(a-amino-3-hydroxy-5-methyli soxazole-4-propionic acid receptor, AMPAR)上膜的调控方面,初步探讨硫化氢对海马脑区神经元兴奋性的调节作用及其分子机制。方法：通过基于生物素交联的硫巯基化检测方法,研究硫化氢对大鼠海马CA1脑区总蛋白、AMPAR和蛋白磷酸酯酶的硫巯基化作用。脑片膜片钳记录硫化氢对海马CA1脑区神经元AMPAR电流的作用。BS3交联和蛋白质免疫印迹方法,研究硫化氢对CA1脑区AMPAR亚基的磷酸化上膜和蛋白激酶磷酸化的作用。结果：硫化氢供体硫氢化钠(sodium hydrosulfide, NaHS,100μM)不影响大鼠海马CA1区AMPAR亚基GluA1和GluA2的总蛋白表达,也不改变GluA2的膜表达,但能显著增加GluA1膜表达和AMPAR介导的电流强度。硫巯基化阻断剂DTT(二硫苏糖醇,dithiothreitol,100μM)抑制NaHS引起的大鼠海马CA1脑区AMPAR膜表达及其介导的电流强度。NaHS增加大鼠CA1脑区总蛋白硫巯基化水平,而对GluA1、 GluA2的硫巯基化水平无显著影响。同时,NaHS增加GluAl亚基Ser845位点和Ser831位点磷酸化水平。另外,DTT能取消NaHS对海马CA1脑区蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)、蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)、钙离子和钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ (Ca2+/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ, CaMKⅡ)的激活作用。NaHS选择性地上调蛋白磷酯酶2A (protein phosphatase2A, PP2A)的硫巯基化水平,因此可能通过抑制PP2A活性而上调突触后蛋白激酶信号以及GluAl的磷酸化和功能。结论：硫化氢通过硫巯基化作用途径促进大鼠海马CA1脑区AMPAR亚基GluAl-Ser845和Ser831位点的磷酸化,进而上调AMPAR的膜表达和突触后信号传递功能。第二部分硫化氢对大鼠皮层神经元兴奋性及癫痫样行为的作用及机制目的：癫痫是伴随脑卒中的一种常见并发症,约占脑卒中患者总数的3%。然而,癫痫与脑卒中两者之间的内在机制联系,仍然不甚明了。硫化氢作为一种气体信号分子,在缺血性大脑损伤过程中具有关键作用。但是关于硫化氢在癫痫发作中的作用,目前还没有相应的研究报道。在本部分研究内容中,我们初步探讨了硫化氢对癫痫样事件的影响及其机制。方法：在戊四氮唑(pentylenetetrazole, PTZ)和毛果芸香碱(pilocarpine)诱导的大鼠癫痫模型上,检测硫化氢对模型癫痫发作的影响。在低镁高钾癫痫模型和4-氨基吡啶(4-amino-pyridine,4-AP)诱导的脑片癫痫模型上,通过膜片钳记录的方法,研究硫化氢对癫痫样动作电位发放、兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic currents, EPSCs)、电压门控型钠离子通道(voltage-gated sodium channels, VGSCs)电流、兴奋性谷氨酸受体离子通道(AMPAR和NMDAR)电流的调节作用。结果：腹腔注射NaHS(11.2mg/kg)增强戊四氮唑(癫痫等级：PTZ30:control,0.75±0.26, NaHS,2.37±0.57; PTZ45:control,2.87±0.44, NaHS,3.5±0.26;PTZ60:control,3.37±0.42,NaHS,4.13±0.29;PTZ75:control,4.12±0.23, NaHS,5.5±0.27)以及毛果芸香碱(癫痫等级：30:control,2.25±0.16,NaHS,3.1±0.38；40:control,3.75±0.4,NaHS,3.88±0.44;50:control,3.63±0.26, NaHS,4.75±0.37:60:control,3.75±0.41,NaHS,4.75±0.42)诱发的癫痫模型发作。NaHS在脑片水平上延长低镁高钾(control,70±19s;NaHS,173±32s)和4.AP(control,29±8s;NaHS,42±13s)诱导的癫痫样动作电位的持续发放时程。在不同的钳制电流下(110-200pA)单独使用NaHS,能够增加大鼠脑片上动作电位的发放频率(110pA:control,5.9±1.8,NaHS,14.2±2.5;120pA:control,9.6±2.1,NaHS,15.8±2.6;130pA:control,10.7±2.4,NaHS,18.1±2.8;140pA:control,13.0±2.4,NaHS,19.6±2.8；150pA:control,14.2±2.6,NaHS,21.7±2.7；160pA:control,16.4±2.8,NaHS,23.8±2.7;170pA:control,17.5±3.0,NaHS,25.1±3.1；180pA:control,19.3±3.3, NaHS,27.1±3.3190pA:control,20.3±3.6,NaHS,28.8±3.6;200pA:control,22.4±3.8,NaHS,30.8±3.4).NaHS上调大鼠皮层神经元自发型兴奋性突触后电流(spontaneous excitatory postsynaptic currents,sEPSC)的幅度(control:31.16±1.09pA;NaHS:37.32±1.68pA)和微小型兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic currents,mEPSC)的幅度(control:22.24±0.38pA;NaHS:25.69±0.66pA).在不影响VGSCs的激活、失活和复活特性的情况下,NaHS能增大VGSCs的电流幅度(NaHS,121.31±3.92％of control;P0.01).另外,NaHS能够增加皮层神经元总的诱发型兴奋性突触后电流(evoked excitatory postsynaptic currents,e-EPSC)幅度至对照组的146.4士10.9%、AMPAR介导的e-EPSC幅度至对照组的143.5士6.6%,以及NMDAR介导的e-EPSC幅度至对照组的128.1士3.1%。使用电压门控型钠通道阻滞剂TTX(1nmol)、NMDAR阻滞剂AP-5(100nmol)和AMPAR阻滞剂CNQX(20nmol)均能取消NaHS对低镁高钾诱导的癫痫样发放以及戊四氮诱导的大鼠癫痫模型发作的促进作用(Control:3.75±0.25,NaHS:5.25±4.12;TTX:2.12±0.55,TTX+NaHS:1.88±0.54;AP-5:3.5±0.57,AP-5+NaHS:2.87±0.72；CNQX:2.38±0.65, CNQX+NaHS:2.25±0.67). 结论：硫化氢通过上调电压门控型钠通道和谷氨酸受体通道活性,增强大脑皮层神经元的兴奋性,易化大鼠癫痫样事件的发生。第三部分硫化氢对大鼠ARC脑区神经元活性及摄食行为的作用及机制目的：硫化氢在机体的许多器官和组织中起到重要的生理或病理作用。已有研究报道提示,内源性硫化氢可能对能量代谢和摄食具有调控作用。下丘脑弓状核(arcuate nucleus, ARC)是控制机体能量代谢与摄食行为的关键调节中枢。饥饿状态下ARC脑区neuropeptide Y (NPY)神经元兴奋,能量平衡因子AMP-activated protein kinase (AMPK)活性升高,介导摄食行为。本部分课题研究硫化氢对ARC神经元AMPK活性和摄食的调控作用。方法：采用大鼠脑室置管给药、摄食行为测试、原代神经元培养、western blotting免疫印迹、生物素交联法和蛋白质硫巯基水平检测、钙离子影像、气体吸入给药、细胞免疫荧光与亲和素免疫组织化学(亲和素-生物素-过氧化物酶法)的方法,研究硫化氢对大鼠摄食行为的调节作用及可能机制。结果：腹腔注射NaHS (8.4mg/kg)可显著短暂(1h)增加大鼠摄食行为。NaHS上调ARC神经元c-Fos的核表达。在整体动物和离体脑片水平,NaHS浓度依赖性地增加下丘脑弓状核AMPK和CaMKII活性。此外,100μM NaHS促进原代培养ARC神经元AMPK和CaMKII的激活。同时,NaHS促进ARC神经元胞浆游离钙离子水平[Ca2+]i的升高,而胞浆游离钙离子螯合剂BAPTA-AM (10μM)能阻断硫化氢对AMPK的激活作用。NaHS不改变ARC总蛋白巯基水平而上调蛋白硫巯基化水平,该作用能被硫巯基化修饰阻断剂DTT (100μM)所阻断。DTT能取消硫化氢对胞浆钙离子水平、AMPK激活和大鼠摄食的上调作用。气体吸入硫化氢(20ppm)显著增加ARC蛋白硫巯基化、AMPK激活以及大鼠摄食。禁食24h不改变下丘脑内的硫化氢合酶——胱硫醚p合酶(cystathionine β-synthase, CBS)的表达,但增加蛋白硫巯基化和AMPK激活水平。DTT可阻断禁食引起的蛋白硫巯基化、AMPK激活和再摄食的增加。结论：硫化氢通过硫巯基化作用,增强ARC神经元胞内钙信号并激活AMPK,进而上调ARC神经元活性和促进大鼠摄食。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741

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