RGMa特异性RNAi转染前后对大鼠小脑神经机能联系不能调控的MR评价

发布时间：2018-03-10 21:21

本文选题：磁共振扩散张量成像　切入点：交叉性小脑神经机能联系不能　出处：《郑州大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：缺血性脑梗死是威胁我国人类健康的常见疾病,是较为严重的缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD)其中之一,其特点为高发病率、高死亡率以及高致残率,部分预后不佳,一旦罹患,势必会为社会及家庭、个人造成负担。因此,越来越多的临床学者聚焦于脑梗死的预后改善及神经功能恢复的研究。随着相关研究的增多,人们发现,脑梗死后不仅原发病灶区域可出现相应的病理生理学改变,其远隔部位如对侧大脑半球和双侧小脑亦可出现继发性的功能及代谢障碍,而这一现象可能在神经功能恢复中起着重要作用,其发生机制与神经机能联系不能学说有关。神经机能联系不能(diaschisis),这个名词提出于上个世纪初,即局限于幕上的脑组织损伤可造成与它有纤维联系的其他区域的功能改变。随着人们对此现象了解的进一步深入以及先进检查手段的运用,对神经机能联系不能的发生发展机制及对于其临床意义的认识都取得了极大的进展,对临床诊断及治疗均起到一定的指导意义,在脑梗死患者的康复过程中亦起到了一定影响。扩散张量成像(diffusion tensor imaging,DTI)是一种用于描述水分子扩散方向特征的磁共振技术,它可以通过计算水分子的弥散程度和弥散方向间接的评价大脑白质纤维的完整性。DTI不只反映水分子扩散受限的整体情况,还反映水分子扩散受限的方向性,是目前唯一一种能有效观察和追踪脑白质纤维束的非侵入性检测方法。RGMa蛋白(Repulsive guidance molecule,A)在中枢神经生长发育的过程中起着重要作用,其介导排斥性轴突导向信号以及神经管的闭合,参与神经元细胞的生长、增殖和分化,参与了脑梗死后神经元及轴突的修复与再生。本实验拟运用RNAi技术,构建重组腺病毒为载体的r Ad5-sh RNA-RGMa,对大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型缺血区域大脑皮质、基底节区进行基因沉默,观察该特异性干预手段对急性局灶性缺血大鼠脑组织RGMa表达水平、轴突生长/再生情况以及神经功能恢复的影响,结合磁共振扩散加权成像检查,进一步阐明RGMa在中枢神经系统轴突再生抑制因子中的重要地位,探讨交叉性小脑神经机能联系不能(crossed cerebellar diaschisis,CCD)的发生机制,为临床脑缺血及CCD的监测评估和治疗寻找有效靶点,为脑缺血后促进神经功能恢复提供依据并奠定基础。本文分为以下三个部分。第一部分RGMa在MCAO大鼠脑组织的表达及与轴突再生的关系目的观察急性局灶性脑缺血损伤大鼠脑组织中RGMa表达水平、轴突生长/再生情况以及对神经功能恢复的影响,结合磁共振扩散加权成像及相关参数的量化评价,为CCD现象的发生发展机制提供实验基础和理论依据,为下一步实验打下基础。方法建立大鼠MCAO模型,将模型组随机分为12h、24h、48h、7d、10d组,与对照组一起分别于相应时间点行MRI扫描,测量ADC值和FA值。扫描后取脑组织,RT-PCR方法检测RGMa和Rho A m RNA的表达情况,免疫组化法检测RGMa、Rho A蛋白、轴突再生情况,TUNEL法检测细胞凋亡情况,电子显微镜观察细胞超微结构变化。结果模型组大鼠梗死侧核心区及双侧小脑ADC值和FA值较正常组降低,12h降至最低,梗死对侧小脑降低较同侧小脑更为显著(P0.05)。术后12h起可见RGMa阳性细胞表达并持续增加,48h表达达高峰,双侧小脑半球RGMa蛋白表达较之对照组均显著升高(P0.05),以右侧小脑为著。RGMa蛋白表达与磁共振参数及轴突生长情况呈显著负相关。结论与正常组相比,大鼠脑梗死后双侧小脑的影像学参数及病理学指标的变化均有统计学意义,且右侧较左侧为著,说明脑梗死后CCD现象存在。RGMa蛋白参与轴突的再生与重塑,间接说明磁共振参数变化及与CCD现象的关联机制,为后续实验打下基础。第二部分RGMa特异性RNAi重组腺病毒的构建目的构建靶向Rat RGMa基因sh RNA腺病毒载体以及完成病毒载体的包装,为下一步实验做准备。方法设计3条靶序列sh RNA进行筛选,设计并合成编码短发夹RNA(sh RNA)序列的DNA单链,退火链接,稀释备用。构建RGMa特异性RNAi腺病毒载体,酶切、测序鉴定后转染PC12细胞进行最佳干扰片段的筛选。反转录-聚合酶链反应检测重组腺病毒r Ad5-sh RNA-RGMa转染PC12细胞后RGMa m RNA的转录抑制情况及重组腺病毒r Ad5-sh RNA-RGMa转染PC12细胞后的转染效率,筛选出最佳干扰片段。结果设计的3条si RNA中,Adv-si R1的转染效率最高,测定其滴度为2.5×109Pfu/ml,用于下部分实验。Adv(-)的测定滴度为2.1×109Pfu/ml,用于阴性对照。结论成功构建靶向Rat RGMa基因的sh RNA腺病毒载体,转染效果稳定有效,可用于下部分实验。第三部分RGMa特异性RNAi转染后MCAO大鼠RGMa表达及MR成像目的采取基因沉默技术,特异性沉默MCAO大鼠脑皮质及基底节RGMa蛋白的表达,观察其对缺血侧脑组织及其远隔部位RGMa表达水平和轴突再生以及大鼠神经功能的影响,为缺血性脑梗死及CCD的治疗提供新的视角。方法建立大鼠MCAO模型,随机分为模型2d组,空白对照2d组,阴性对照2d组,RNAi干预2d组,分别于相应时间点行磁共振检查,每组4只应用western blotting方法检测RGMa蛋白的表达情况,8只应用免疫组化法检测RGMa蛋白及轴突再生情况。结果与模型组相比,干预组梗死核心区即左侧基底节区ADC值及FA值有所升高,RGMa蛋白表达降低(P0.05),阴性对照组和空白对照组与模型组相比无明显变化。双侧小脑ADC值及FA值、RGMa蛋白表达4组无差异。结论给予RGMa特异性RNAi重组腺病毒Adv-sh RNA-RGMa行干预治疗后,大鼠幕上脑组织RGMa表达降低,磁共振参数升高,说明该方法对于脑梗死的治疗有效,为临床脑梗死的治疗提供了新的靶点及无创性监测手段。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743.3

【参考文献】