蛙皮素促进内嗅皮层神经元GABA释放在抑制癫痫样活动中的机制研究

发布时间：2018-03-15 21:55

本文选题：蛙皮素　切入点：癫痫　出处：《第四军医大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：癫痫（Epilepsy）近十年来发病率逐年增加，据世界卫生组织2012年底统计，全球患者约5000万，现已成为仅次于脑血管病的第二大神经系统常见疾患。最新流行病学研究表明，癫痫的全世界平均发病率高达0.7%，这其中有近30%的患者无法通过传统药物或其他治疗手段使病情得以控制，有近一半癫痫患者的平均寿命仅为55岁，他们在生存质量明显下降的同时也给家庭和社会增加了大量的心理和经济负担，而以上情势在以我国为代表的发展中国家显得更为突出和严峻。尽管世界各国针对癫痫发病机制和治疗手段进行了长达数十年的实验室和临床研究，但迄今为止对其具体发生机理仍然不清楚，经典的抗癫痫药物治疗又往往带来耐药性和毒副作用等问题，因此从疾病机制研究入手，寻找更为安全、有效的治疗手段就显得尤为重要。蛙皮素（Bombesin）是一种含14个氨基酸残基的生物活性多肽。研究发现它作为一种脑肠肽在哺乳动物体内广泛存在，并且通过G蛋白偶联受体在神经系统肿瘤、脑缺血再灌注损伤以及学习记忆功能形成中均发挥了重要作用。新近研究表明，在退行性神经系统疾病帕金森病（Parkinson's disease）和老年痴呆症（Alzheimer'sdisease）发病过程中Bombesin表达量均明显改变；同时，作为海马神经纤维最为重要的投射区域，内嗅皮层（Entorhinal cortex）在情绪和神经系统兴奋性调节方面亦扮演着极为重要的角色。本研究旨在观察Bombesin可以促进GABA能中间神经元递质释放，进一步阐明Bombesin调节内嗅皮层抑制性神经元兴奋性和调节递质突触传递的机制，最终证实Bombesin通过增加内嗅皮层抑制性神经递质释放从而减少神经元异常兴奋，并可作为内源性多肽物质抑制癫痫发生，为癫痫机制研究和临床抗癫痫药物研发提供科学依据。实验一：蛙皮素对内嗅皮层神经元自发抑制性突触后电流（sIPSCs）的影响目的：观察给予Bombesin后内嗅皮层Stellate和Pyramidal神经元自发抑制性突触后电流（sIPSCs）的变化情况。方法：（1）使用15~20天雄性SD大鼠离体脑片，采用全细胞电压钳分别记录给予Bombesin后内嗅皮层区域II层两种主要神经元Stellate和Pyramidal自发抑制性突触后电流（sIPSCs）的频率及振幅变化情况；（2）观察不同浓度（0.01/0.05/0.075/0.1/0.25/0.5μM）Bombesin对Stellate神经元sIPSCs变化产生的剂量效应关系；（3）观察给予Bombesin两种受体拮抗剂后Stellate神经元sIPSCs变化情况；（4）观察给予Bombesin的两种相似肽NMB/GRP对于Stellate神经元sIPSCs的影响。结果：（1）给予0.25μM Bombesin后明显增加了Stellate和Pyramidal自发抑制性突触后电流（sIPSCs）的频率（Stellate:204±26%of Control, P=0.01/Pyramidal:196±15%of Control, P=0.002，n=10）及振幅（128±6%of Control, P=0.006/Pyramidal:126±6%ofControl, P=0.003，n=10）；（2）通过外源性给予七种不同梯度剂量Bombesin后计算出剂量效应关系曲线，得出EC50=42nM；（3）给予BB1/BB2非选择性受体拮抗剂PD176252（10μM）后可以明显抑制Bombesin所诱导的Stellate神经元sIPSCs频率（136±12%of Control, P=0.034，n=10）和振幅（122±13%of Control, P=0.19，n=10）增加，给予选择性BB2受体拮抗剂(D-Phe6, Leu-NHEt13, des-Met14)-Bomsesin(6-14)（6μM）后没有抑制Bombesin所诱导的Stellate神经元sIPSCs频率（180±21%ofControl, P=0.43，n=10）和振幅（129±8%of Control, P=0.98，n=10）增加，（4）给予选择性BB1受体激动剂相似肽NMB（0.25μM）可以模拟出Bombesin所诱导的Stellate神经元sIPSCs频率（188±26%of Control, P=0.027，n=6）和振幅（152±16%of Control,P=0.036，n=10）的明显增加，给予选择性BB2受体激动剂相似肽GRP（0.25μM）同样可以模拟出Bombesin所诱导的Stellate神经元sIPSCs频率（190±24%of Control,P=0.02，n=10）和振幅（129±4%of Control, P=0.004，n=10）的明显增加。实验二：蛙皮素对内嗅皮层神经元微小抑制性突触后电流（mIPSCs）和诱发抑制性突触后电流（eIPSCs）的影响目的：研究Bombesin促进神经元GABA释放的突触作用机制。方法：（1）使用15~20天雄性SD大鼠离体脑片，，采用全细胞电压钳阻断动作电位后给予Bombesin记录内嗅皮层区域Stellate神经元微小抑制性突触后电流（mIPSCs）的频率及振幅变化情况；（2）去除细胞外液Ca2+或使用电压门控Ca2+通道阻断剂Cd2+/Ni2+（100μM）后给予Bombesin观察sIPSCs的变化情况；（3）使用刺激电极对内嗅皮层区域进行刺激，观察给予Bombesin后eIPSCs的变化情况；（4）给予Bombesin的同时使用刺激电极对内嗅皮层区域进行成对刺激（50ms,0.1Hz）并记录eIPSCs，观察PPR的变化情况。结果：（1）阻断动作电位后，给予Bombesin后Stellate神经元mIPSCs频率（109±5%of Control, P=0.12，n=10）和振幅（96±2%of Control, P=0.14，n=10）没有明显变化；（2）使用无Ca2+细胞外液灌流后可以明显抑制Bombesin所诱导的Stellate神经元sIPSCs频率（117±14%of Control, P=0.27，n=10）和振幅增加（95±3%of Control,P=0.12，n=10）；正常人工脑脊液加入电压门控Ca2+通道阻断剂Cd2+/Ni2+后灌流可以明显抑制Bombesin所诱导的Stellate神经元sIPSCs频率（133±34%of Control, P=0.56，n=10）和振幅增加（96±2%of Control, P=0.07，n=10）；（3）给予Bombesin并使用刺激电极后发现其可以明显降低第一刺激eIPSCs振幅（85±5%of Control, P=0.04，n=5）；（4）给予Bombesin并使用刺激电极后记录eIPSCs并对成对刺激进行PPR计算，其可以明显增加PPR值。实验三：蛙皮素促使内嗅皮层GABA能中间神经元去极化及其机制研究目的：研究Bombesin促进内嗅皮层GABA能中间神经元递质释放的机制。方法：（1）使用15~20天雄性SD大鼠离体脑片，使用全细胞电流钳鉴定内嗅皮层III层GABA中间神经元种类，并且给予Bombesin后观察膜静息电位（RMPs）和输入电阻（Input Resistance,-50pA,500ms）的变化情况；（2）使用电流钳观察给予Bombesin后中间神经元动作电位的变化情况；（3）使用电压钳，钳制电压保持-60mV，观察给予Bombesin后中间神经元钳制电流的变化情况；（4）使用Na+/Ca2+阻断剂后给予Bombesin，观察中间神经元膜电位变化情况；（5）灌流（μM）100Cd2+/0.5TTX/100Ni2+/10DNQX/50APV/10Bicuculline后给予Bombesin，记录Ramp电压-电流曲线（-120~-60mV,0.1mV/ms）；（6）给予Bombesin的同时使用内向整流钾离子通道（inward rectifier K+channels, Kirs）阻断剂Ba2+（0.5mM）观察中间神经元膜电位以及内嗅皮层II层Stellate神经元sIPSCs频率变化情况。结果：（1）确认所记录神经元为GABA能I/II型中间神经元，给予Bombesin发现神经元膜电位发生明显去极化现象（Control:-63.7±0.8mV, BB:-61.6±0.9mV, n=8,P=0.001），同时输入电阻也明显增加（Control:315±36M, BB:362±46M, n=8,P=0.026）；（2）给予Bombesin后观察到中间神经元动作电位频率明显增加（416±54%of Control, n=6, P=0.001）的同时振幅略有减小（92±1%of Control, n=6, P=0.001）；（3）将神经元钳制在-60mV后给予Bombesin，发现钳制电流发生明显增加（-8.7±1.4pA,n=6, P=0.001）；（4）使用Na+阻断剂NMDG-Cl无法抑制Bombesin所诱导的中间神经元膜电位去极化的发生（2.5±0.3mV, n=7, P=0.001），使用EGTA-0Ca2+细胞外液灌流后无法抑制Bombesin所诱导的中间神经元膜电位去极化的发生（3.2±1.6mV,n=7, P=0.7）；（5）灌流（μM）100Cd2+/0.5TTX/100Ni2+/10DNQX/50APV/10Bicuculline后给予Bombesin记录Ramp电压-电流曲线，发现其反转电位为-85.6mV，接近于K+电位；（6）给予Bombesin的同时使用内向整流钾离子通道（inward rectifierK+channels, Kirs）阻断剂Ba2+（0.5mM），发现中间神经元膜电位没有明显变化（0.5±0.4mV, n=7, P=0.25），同时内嗅皮层II层Stellate神经元sIPSCs频率也没有发生明显改变（228±45%of Control, n=8, P=0.026）。实验四：蛙皮素和其相似肽在无Mg2+诱导的内嗅皮层癫痫样活动中的作用研究目的：观察Bomsesin和其相似肽对于癫痫活动的抑制作用。方法：使用15~20天雄性SD大鼠离体脑片，正常温育结束后使用无Mg2+人工脑脊液继续孵育1~3小时，随后持续无Mg2+细胞外液灌流并使用场电位记录癫痫活动15分钟，随后分别给予Bombsin或其相似肽NMB/GRP（0.25μM）15分钟，停药后继续洗脱记录30分钟，记录并比较全程癫痫样活动的变化情况。结果：无Mg2+细胞外液灌流诱发脑片癫痫样活动成功，给予Bombesin（0.25μM）后可以明显抑制内嗅皮层区域癫痫样活动（Control:4.38±1.12events/min, BB:1.07±0.43events/min, n=6）,给予NMB（0.25μM）后同样可以明显抑制内嗅皮层区域癫痫样活动（Control:10.30±1.29events/min, NMB:2.04±0.88events/min, n=6），给予GRP（0.25μM）后亦可以明显抑制内嗅皮层区域癫痫样活动（Control:5.93±1.67events/min, GRP:0.93±0.35events/min, n=6）。结论 1．蛙皮素通过作用于BB1/BB2受体增加神经元突触前GABA释放，但对突触后GABA受体数量没有影响。 2．蛙皮素通过抑制Kris引起GABA能中间神经元去极化，并通过动作电位频率增加激活电压依赖型钙通道，最终增加GABA释放。 3．蛙皮素和其相似肽所引起的GABA释放增加的易化作用可以明显抑制神经元的癫痫活动。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R742.1

【参考文献】