枸杞多糖通过增加AKT活性降低突变亨廷顿蛋白的细胞毒性

发布时间：2018-03-20 00:34

本文选题：亨廷顿病　切入点：突变亨廷顿蛋白　出处：《华中科技大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：亨廷顿病(Huntington's disease,HD)是一种迟发性常染色体显性遗传的神经退行性疾病,临床上主要表现为进行性运动障碍和认知减退,病理学上以大脑皮质和纹状体神经元的大量退化、丢失为特征。HD由HD基因突变所致。HD基因第一外显子中存在CAG三核苷酸重复序列,其编码产物为亨廷顿蛋白(huntingtin, Htt)氨基末端的一段多聚谷氨酰胺片段(Poly-Q)。突变的HD基因会编码产生具有超长Poly-Q结构的突变亨廷顿蛋白(mutant huntingtin,mHtt)。mHtt会被多种蛋白酶切割从而形成不同长度的N末端毒性片段。mHtt的错误折叠是HD神经病理学损害的物质基础,减少其形成或促进其清除对延缓HD的病理学进程具有重要意义。枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide, LBP)是枸杞提取物的主要成分,具有多种生物学功能,如护肝、减轻Ⅱ型胶原蛋白引发的关节炎、提高机体免疫力、改善糖尿病中的胰岛素抵抗缓解疾病进程,以及通过阻止神经元凋亡来减轻局灶性脑血拴所带来的脑损伤、抵抗β样淀粉蛋白所带来的神经毒性等神经保护作用。LBP发挥这些生物学功能主要通过以下机制：如与p53信号通路相关、能激活Nrf2/HO-1抗氧化通路、通过磷酸化来激活氨基末端激酶(c-Jun of N-terminal kinase,JNK)等。其中,激活的Nrf2能帮助抵制活性氧(reactive oxygen species,ROS)所带来的细胞损伤,并激活PI3K-AKT通路来防止细胞凋亡。AKT,又称为蛋白激酶B (Protein kinase B, PKB),属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族。AKT结构域中含有两个激酶催化的关键性磷酸化位点：308位上的苏氨酸(Thr308)及473位上的丝氨酸(Ser473)。人们通常通过检测Ser473位磷酸化来判断AKT是否活化以及活化程度。在表达mHtt的纹状体细胞、脑部转染mHtt的HD大鼠模型和HD患者标本中均有AKT活性降低；在HD细胞模型中使用AKT激活剂胰岛素和IGF-1激活AKT后能抑制细胞线粒体途径的细胞凋亡：活化的AKT能通过磷酸化Htt的Ser421位点,减少mHtt的核内聚集,并阻断mHtt所引发的细胞凋亡来缓解HD病症。因此,AKT活性降低与mHtt毒性有关,增强AKT活性则可能减轻mHtt毒性。HD中AKT活性降低及LBP对AKT的激活作用提示LBP可能通过调节AKT活性而在HD中发挥神经保护作用,因此,本研究利用稳定表达mHtt的HD细胞模型和HD转基因小鼠,观察了LBP对mHtt毒性的影响,并对其机制进行了初步探讨。1.枸杞多糖降低突变亨廷顿蛋白的细胞毒性为了明确LBP对mHtt的毒性是否具有抑制作用,首先观察了LBP对稳定表达mHtt的HEK293细胞活力和caspase-3活性的影响。首先通过G418筛选法筛选出稳定表达EGFP-20Q与EGFP-160Q的单克隆HEK293细胞系。用不同浓度的LBP(0.384、1.92、9.6、48、240、1200、6000或30000 μg/ml)处理稳定表达正常Htt (20Q-Htt) HEK293细胞(HEK293-20Q细胞)或mHtt (160Q-Htt)的HEK293细胞(HEK293-160Q细胞)24 h后,CCK8法检测显示,0.384 jig/ml LBP即可明显增加两种细胞的细胞活力,随着LBP浓度增加,细胞活力增强作用逐渐明显,在9.6 μg/ml时细胞活力增加最明显。随着LBP浓度的进一步增加,细胞活力不再继续增加,至1200 p.g/ml时,细胞活力反而下降,即表现药物毒性。因此,以9.6μml为抑制mHtt毒性的最佳浓度。应用酶标法检测caspase-3活性显示,HEK293-160Q细胞中caspase-3的活性显著高于HEK293-20Q细胞；9.6μg/ml LBP处理24 h后可显著降低160Q-Htt HEK293细胞的caspase-3活性,即对mHtt的细胞凋亡毒性具有明显的抑制作用。2.枸杞多糖使HD转基因小鼠寿命延长、体重增加、运动功能改善为了明确LBP是否减轻HD转基因小鼠中mHtt的毒性,继而观察了LBP对HD转基因小鼠生存率、体重和运动功能影响。从小鼠第8w起进行LBP灌胃处理至小鼠自然死亡,记录小鼠最终自然死亡时间并用Kaplan-Meier法进行生存率统计学分析,结果显示,蒸馏水灌胃组的TG组小鼠寿命为111.7±12.3 d, LBP灌胃的TG小鼠平均寿命为136.0±25.6 d,即LBP处理能明显延长HD转基因小鼠的寿命。对18 w各组小鼠的体重比较显示,蒸馏水灌胃的WT小鼠和LBP灌胃的WT小鼠体重分别为24.7±2.7 g和25.7±2.8 g,蒸馏水灌胃的TG小鼠体重为17.7±0.7 g,而LBP灌胃的TG小鼠体重为22.0±1.6 g,表明LBP处理可明显抑制TG小鼠体重的减轻。转轴实验显示,LBP处理能使HD转基因小鼠在转棒仪上的停留时间从蒸馏水灌胃的TG小鼠的25.7±3.2 s延长到LBP灌胃的TG小鼠的37.0±4.6 s。步态实验显示,LBP能缩短HD转基因小鼠的步宽、减少前后爪间的重叠距离,改善步态紊乱,运动功能障碍得到明显改善。上述结果说明LBP能明显减轻HD转基因小鼠中mHtt的毒性。3.枸杞多糖减少突变亨廷顿蛋白因为高水平mHtt的存在会使细胞产生获得性毒性,为了明确细胞毒性降低是否与mHtt有关,我们检测了LBP对mHtt的影响。首先,我们在细胞水平进行了mHtt检测,免疫印迹和聚集物滤过陷阱实验结果显示,使用LBP7d后,HEK293-160Q细胞中可溶型和聚集型mHtt均发生显著性降低,但未对HEK293-20Q细胞中的Htt水平产生影响。RT-PCR分析显示,LBP对与mHtt融合的GFP mRNA表达水平无明显影响。为了明确LBP是否减少HD转基因小鼠中的mHtt,继而观察了HD小鼠脑组织中mHtt的变化。免疫组织化学染色显示,在第18w时,LBP处理的TG小鼠皮质、纹状体和海马中Htt免疫反应性较未用LBP处理的TG小鼠明显减弱；免疫印迹检测表明,LBP处理的TG小鼠皮质、纹状体和海马中聚集性和非聚集性mHtt水平均较未用LBP处理的TG小鼠明显降低；RT-PCR分析显示,LBP处理对TG小鼠皮质、海马、纹状体中的mHtt mRNA水平无明显影响。以上结果表明,LBP不改变mHtt的表达,其减少mHtt的作用可能通过促进mHtt降解来实现。4.枸杞多糖通过激活AKT活性来抑制突变亨廷顿蛋白的细胞毒性为了明确LBP是否通过减轻mHtt对AKT活性的抑制而减轻mHtt的细胞毒性,我们首先检测了HEK293-160Q细胞和HD转基因小鼠中LBP对AKT活性的影响。免疫印迹结果显示,在HEK293-20Q细胞中,LBP对AKT活性没有影响,但加入PI3K/AKT阻断剂LY294002抑制AKT磷酸化后,发现LBP可减轻LY294002对AKT活性的抑制。HEK293-160Q细胞的AKT磷酸化水平低于HEK293-20Q细胞,LBP处理能使HEK293-160Q细胞中AKT活性的抑制显著减轻,LBP对这种HEK293-160Q细胞中AKT活性抑制的减轻效应可被LY294002明显阻断。我们同时对AKT的作用底物GSK3β在Ser9位点的磷酸化进行了检测,结果显示,LBP和／或LY294002处理后,HEK293-20Q和HEK293-160Q细胞中的GSK3p-Ser9磷酸化水平均未发生改变。对TG小鼠脑内AKT活性检测显示,与WT小鼠相比,TG小鼠的皮质、海马、纹状体中AKT-Ser473磷酸化显著减少；LBP能显著抑制TG小鼠皮质、海马、纹状体中mHtt对AKT在Ser473位的磷酸化的减少。然而,使用LBP并未使WT小鼠脑中出现AKT活性的显著差异,这也与我们在HEK293-20Q细胞中的检测结果一致。我们同时也进行了GSK3β在Ser9位的磷酸化检测,结果与细胞水平结果一致,并未出现差异。上述细胞和动物水平的结果均证明,LBP能减轻mHtt对AKT活性的抑制。为了明确LBP这种减轻mHtt抑制AKT活性的作用是否与其减轻mHtt毒性的效应有关,进一步观察了AKT活性抑制剂LY294002对LBP减轻mHtt毒性的影响。免疫印迹及聚集物滤过陷阱分析显示,LY294002可显著增加HEK293-160Q细胞中可溶型和聚集型mHtt水平,并显著抑制LBP对HEK293-160Q细胞中可溶型和聚集型mHtt水平的降低；CCK8细胞活力实验显示,LY294002能明显抑制LBP对mHtt降低细胞活力效应的抑制作用,Caspase-3活性酶标检测结果显示,LY294002也能显著阻断LBP对mHtt激活caspase-3活性的抑制作用。由此表明,LBP可通过减轻mHtt对AKT活性的抑制或增加AKT活性而减少mHtt水平、减轻mHtt对细胞活力的抑制、抑制mHtt对caspase-3的激活而减轻mHtt的细胞毒性。结论：本研究证明枸杞多糖能通过增加AKT活性促进突变亨廷顿蛋白降解,减少突变亨廷顿蛋白毒性引起的细胞活力降低和caspase-3活性升高,使HD转基因小鼠寿命延长、体重增加、运动功能改善,由此为枸杞多糖作为治疗HD或控制HD进展的药物提供了实验依据。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R741

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