NLRP3炎症小体在帕金森病神经炎症中的作用及治疗学意义研究

发布时间：2018-03-22 03:01

  本文选题：NLRP3炎症小体　切入点：帕金森病　出处：《南京医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease,PD)是以黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元变性缺失和神经元内路易小体(Lewy body)沉积为特征的第二大神经退行性疾病(Neurodegenerative Diseases),我国65岁以上人群中PD的发病率约为2%。临床表现主要以运动迟缓、静止性震颤、肌强直和姿势步态障碍为主,严重危害中老年患者的生活质量。左旋多巴(L-DOPA)被广泛认为是治疗PD最为有效的药物,但是长期大剂量使用L-DOPA治疗PD后,约有75%PD患者会出现严重的运动并发症(如开关现象、异动症、剂末现象),严重影响PD患者日常生活。目前PD药物治疗主要以改善PD临床症状为主,并不能阻止PD疾病进展,而具有神经保护或神经修复的PD治疗药物仍然没有被证实。PD病理改变以脑内a-突触核蛋白(a-synuclein)聚集导致中脑黑质致密部(SNc)区DA能神经元缓慢、进行性变性丢失。目前研究认为DA能神经元变性坏死的病理机制可能与中脑SNc区持续存在的神经炎症、线粒体功能障碍、氧化性应激、蛋白质聚集和错误折叠、兴奋性毒性等机制交叉互联有关。然而PD确切的病理机制仍不清楚,已成为制约PD治疗学发展的瓶颈。因此,加强PD的病因学研究,进一步揭示PD发生发展的病理分子机制,将为PD的神经保护治疗提供新方向和新策略。近年来研究认为神经炎症在PD中持续存在,参与PD的发生发展,最终诱发DA能神经元变性坏死。流行病学发现2型糖尿病(Type 2 diabetes,T2D)可使PD患病风险增高,研究认为这可能与T2D诱发的外周代谢性炎症有关,但其病理机制尚不明确。外周代谢性炎症及神经炎症均涉及经典的炎症信号传导通路(如NF-κB通路)的激活及相关促炎细胞因子的表达上调。因此,外周代谢性炎症反应是否通过介导中枢神经炎症导致PD的发生发展还需进一步研究证实。NLRP3 (NOD-like receptor pyrin domain containing three,NOD样受体热蛋白结构域3)炎症小体是NOD样受体(NLR)激活后形成的巨大蛋白复合体,也是近年来研究最多最好的炎症小体。NLRP3炎症小体作为活化半胱天冬酶-1(caspase-1)的重要复合蛋白平台,调控白介素(Interleukin,IL)-1β(IL-1β)、白介素-18(IL-18)等上游促炎细胞因子的成熟和分泌,进一步介导下游炎症级联反应。IL-1β作为不可或缺的上游炎性因子,能介导多种炎性因子表达上调,诱发炎症反应。IL-1β的激活受双信号通路控制,一方面核转录因子(NF-κB)信号通路激活释放无活性的IL-1β前体(pro-IL-1β),另一方面NLRP3炎症小体分子平台促使caspase-1成熟,剪切pro-IL-1β激活IL-1β,介导炎症反应。研究报道NLRP3炎症小体激活后介导的炎症级联反应可能参与PD等神经退行性疾病的发生发展,但是NLRP3炎症小体是否参与PD神经炎症病理损伤机制尚未见确切报道。本文第一部分工作,应用LPS+ATP双信号诱导RAW264.7巨噬细胞建立外周炎症损伤细胞模型,并用激活的RAW264.7巨噬细胞上清液进一步诱导BV2小胶质细胞建立中枢神经炎症细胞模型。通过离体实验研究z-YVAD对RAW264.7巨噬细胞诱导的BV2小胶质细胞炎症反应具有抑制作用。结果发现z-YVAD通过抑制NLRP3炎症小体表达水平,可以有效减少LPS所致的炎症反应,表明caspase-1和NLRP3炎症小体可能参与PD神经炎症及外周炎症损伤机制,并有可能成为保护DA能神经元、治疗PD的重要靶点。基于第一部分工作发现NLRP3-caspase-1炎症小体参与巨噬细胞和小胶质细胞介导的炎症反应,本文第二部分工作采用外周注射MPTP制备亚急性PD小鼠模型,同时外周给予GM1治疗。观察GM1对PD神经损伤的保护作用及其与NF-κB信号通路和NLRP3-caspase-1炎症小体的相关性。结果表明GM1能够改善MPTP诱导PD小鼠模型行为学功能,减少中脑SNc区DA能神经元的死亡数量,抑制中脑SNc区小胶质细胞和星形胶质细胞活化,减轻NLRP3-caspase-1炎症小体表达上调。结果表明GM1能够通过抑制NLRP3炎症小体减轻中脑SNc区DA能神经元变性坏死。该发现不仅为GM1对PD神经保护作用提供直接证据,而且表明GM1对PD的神经保护机制涉及抑制NLRP3炎症小体,为PD研发神经保护药物提供新方向和新策略。本文工作研究结果不仅对神经炎症参与PD病程的发生发展提供直接的支持证据,同时也为外周炎症参与PD的发生发展奠定了一定的研究基础。结果表明caspase-1及NLRP3炎症小体参与PD神经炎症及全身炎症损伤机制,因此多靶点抗炎治疗有可能成为保护DA能神经元、治疗PD的新的思路和新的策略。第一部分Caspase-1在RAW264.7巨噬细胞诱导BV2小胶质细胞活化中的作用_及其机制目的：研究caspase-1及NLRP3炎症小体在RAW264.7巨噬细胞诱导BV2小胶质细胞活化过程中的作用及其机制。方法：应用LPS+ATP诱导RAW264.7巨噬细胞建立外周炎症损伤细胞模型,并用激活的RAW264.7巨噬细胞上清液进一步诱导BV2小胶质细胞建立中枢神经炎症细胞模型,研究caspase-1抑制剂(z-YVAD)对BV2小胶质细胞保护作用及其机制。ELISA法检测RAW264.7巨噬细胞及BV2小胶质细胞上清液中相关炎症因子(IL-1p、IL-6、TNF-a)的表达水平；Western blotting分析检测NF-κB信号通路相关蛋白及NLRP3炎症小体的表达水平；应用共聚焦显微镜观察p65核转位情况。结果：1、LPS+ATP刺激RAW264.7巨噬细胞,ELISA法检测其上清液中相关炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-a)的表达上调；Western blotting分析发现NF-κB信号通路相关蛋白及NLRP3炎症小体表达明显升高。Caspase-1抑制剂可有效抑制上述炎症因子及相关蛋白的表达,表明caspase-1抑制剂可显著抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应。(*p0.05,**p0.01 and ***p0.001)2、由激活的RAW264.7巨噬细胞上清液诱导BV2小胶质细胞活化,ELISA法检测发现其上清液中相关炎症因子(IL-1p、IL-6.TNF-a)的表达上调；Western blotting分析发习NF-KB信号通路相关蛋白及NLRP3炎症小体表达也明显升高；共聚焦显微镜观察到p65入核。Caspase-1抑制剂通过对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的抑制作用,可进一步显著抑制BV2小胶质细胞的炎症因子及相关蛋白的表达。表明经z-YVAD预处理后,LPS+ATP诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应对BV2小胶质细胞的活化作用明显减轻。(*p0.05,**p0.01 and ***p0.001)结论：1、抑制caspase-1能够减轻LPS+ATP诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应对BV2小胶质细胞的激活作用。2、Caspase-1抑制剂通过抑制NLRP3炎症小体表达水平,可以有效减少LPS所致的炎症反应。——NLRP3炎症小体可能参与PD神经炎症损伤机制,并有可能成为保护DA能神经元、治疗PD的重要靶点,本研究为PD的病因治疗学提供新策略和新方向。第二部分GM1对MPTP诱导的PD小鼠模型的神经保护作用及其机制目的：观察GM1对PD神经损伤的保护作用及其与NF-κB通路和NLRP3-caspase-1炎症小体的相关性。方法：5周龄C57BL/6小鼠随机分为对照组(CON)、MPTP组及MPTP+GM1组。实验第1-3天：MPTP+GM1给予25mg/kg GM1腹腔注射,每天一次,连续3天,对照组及MPTP组给予等量生理盐水。实验第4-8天：MPTP组及MPTP+GM1组皮下注射25mg/kgMPTP,每天一次,连续5天；MPTP+GM1组25mg/kg GM1腹腔注射,每天一次,连续5天,对照组给予等量生理盐水。分别评估各组PD小鼠模型行为学变化。免疫组织化学染色观察中脑黑质TH阳性细胞数量和小胶质细胞及星形胶质细胞活化数量；Western blotting法检测上述脑区NF-κB信号通路的激活情况(胞核p65、胞浆p65、P-IKKβ)及NLRP3炎症小体(NLRP3、caspase-1)的表达情况。ELISA法检测PD小鼠模型外周血清中及中脑SNc区脑组织中的相关炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-a)的表达水平。结果：1、相较于MPTP组,GM1+MPTP组PD小鼠模型行为学功能明显改善。表明GM1能够抑制：MPTP诱导的DA能神经元损伤作用,改善PD动物模型的运动功能。(—0.05,**p0.01)2、与MPTP组相比,GM1+MPTP组PD小鼠模型中脑黑质TH细胞死亡数量减少,小胶质细胞及星形胶质细胞的活化数量亦明显减少。表明GM1能够减少PD动物模型中脑黑质TH细胞的死亡以及抑制小胶质细胞及星形胶质细胞的激活。(**p0.01)3.MPTP诱导的PD小鼠模型中脑SNc脑组织中存在NF-κB通路的激活,胞核p65、P-IKKβ相关蛋白均表达增加；GM1能够有效抑制上述NF-κB通路相关蛋白的表达水平上调。另外,Western blotting分析发现GM1能有效减少中脑SNc脑组织中NLRP3炎症小体(NLRP3、caspase-1)表达水平。(*p0.05,**p0.01)4、MPTP诱导PD小鼠模型外周血清中及中脑SNc区脑组织中相关炎症因子(IL-1p、IL-6、TNF-a)的表达上调。GM1能够有效抑制上述炎症因子的表达。(*p0.05,**p0.01)结论：1、GM1能够改善MPTP诱导的PD小鼠模型的行为学及病理学损伤,发挥神经保护作用。2、GM1神经保护作用的机制涉及抑制NLRP3-caspase-1炎症小体,减少神经炎症导致的DA能神经元变性坏死。综上所述,本文的主要创新之处在于：1、NLRP3-Caspase-1炎症小体与PD等神经退行性疾病的神经炎症病理机制密切相关本文通过离体研究发现抑制caspase-1可以减轻激活的RAW264.7巨噬细胞对BV2小胶质细胞的活化作用,提示caspase-1和NLRP3炎症小体参与巨噬细胞及小胶质细胞介导的炎症反应,表明caspase-1和NLRP3炎症小体参与PD等神经退行性疾病的神经炎症及全身炎症病理损伤机制,进一步揭示caspase-1和NLRP3炎症小体可作为PD等神经退行性疾病的全身炎症多靶点调控机制。2、GM1对MPTP诱导PD小鼠模型的神经保护机制涉及抑制NLRP3炎症小体本文通过在体研究发现GM1能够改善MPTP诱导PD小鼠模型运动功能障碍,减少中脑SNc区DA能神经元的死亡数量以及中脑SNc区小胶质细胞及星形胶质细胞的活化数量,抑制NF-κB通路相关蛋白和NLRP3-caspase-1炎症小体的表达水平上调以及减轻外周血清中及中脑SNc区脑组织中相关炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-a)的表达情况。研究表明MPTP诱导的PD小鼠模型中脑SNc区存在炎症反应并导致DA能神经元缺失,而GM1能够通过抑制NLRP3-caspase-1炎症小体减少DA能神经元变性坏死。该发现不仅为GM1对PD的神经保护作用提供直接证据,而且表明GM1对PD的神经保护机制涉及抑制NLRP3炎症小体,为PD研发神经保护药物提供新方向和新策略。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.5

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本文编号：1646741