DNMT1介导miRNA-20a调控胶质瘤细胞替莫唑胺耐药性的机制研究
本文选题：DNMT1 切入点：miRNA-20a 出处：《浙江大学》2016年博士论文
【摘要】：研究背景胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发恶性肿瘤,具有侵袭性强、恶性进展快、极易复发、预后差等特点。虽然以手术为主、结合放疗和化疗为辅的综合治疗方法使胶质瘤患者的生存期有所延长,但其总体的治疗效果仍然欠佳。化疗在恶性胶质瘤临床治疗中的作用越来越被重视,而替莫唑胺是目前我们临床治疗神经肢质瘤的一线化疗药物,但替莫唑胺耐药成为胶质瘤化疗失败的主要原因。肢质瘤对替莫唑胺耐药的机制尚不完全清楚,寻找预防和治疗胶质瘤细胞替莫唑胺耐药的新型靶标,对进一步提高神经胶质瘤的治疗水平具有重大意义。近年来随着微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)研究的持续深入进行,发现miRNAs在各类恶性肿瘤的发生发展中经常扮演着非常重要的角色,根据不同的靶向基因可能拥有与类似癌基因或抑癌基因的作用,且在神经胶质瘤细胞化疗耐药中也发挥着重要作用。miRNAs是一类大小约19-25个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA,普遍存在于真核生物细胞中。大部分miRNA主要通过与靶基因mRNA3'末端非翻译区(3' UTR)完全或不完全互补的特异性结合使其降解,偶尔也与靶基因mRNA 5'末端非翻译区(5' UTR)结合,在转录后水平上抑制靶基因翻译,从而实现基因表达的负性调控。miR-20a是miR-17-92基因簇的一员,该基因簇共包含7个miRNAs:miR-17-3p、miR-17-5p、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a 和 miR-92a-16。目前的研究显示miR-20能促进肿瘤细胞生长增殖、侵袭迁移,抑制细胞凋亡,在肢质瘤中发挥着癌基因的作用。本课题前期实验研究证明miR-20a在肢质瘤细胞内高表达且负向调控靶基因LRIG1,与促进胶质瘤细胞替莫唑胺耐药相关;LRIG1可负性调节EGFR信号通路而发挥抑癌基因作用,增加胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性。越来越多的研究发现DNA甲基化能够调控约50%miRNAs的表达,而这其中又有约近半数的miRNAs在大量人类恶性肿瘤中存在异常的甲基化修饰。miRNAs启动子区域CpG岛甲基化程度的改变可以影响miRNA表达和下游目标mRNAs的调节。甲基转移酶(DNAmethyltransferases,DNMTs)介导的DNA甲基化是表观遗传学基因调控的一个主要手段。DNA甲基化是在DNMTs(DNMT1,DNMT3a和DNMT3b等)催化下以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基的供体,将甲基基团转移到CpG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上,使得5C位点上的氢被活性甲基基团取代而转变成5-mC(5-甲基胞嘧啶)的化学修饰过程。目前研究发现DNMTs与多种癌症化疗耐药相关,但DNMTs参与胶质瘤耐药的机制尚未清楚且研究较少。综上所述,本课题旨在通过对DNMT1表达与miR-20a启动子区CpG岛甲基化水平的研究,从而发现DNA甲基化异常与miR-20a表达之间的关系,研究DNMT1调节miR-20a表达及对其靶基因LRIG1和其下游信号通路的影响,进而明确DNMT1和miR-20a参与胶质瘤替莫唑胺耐药的潜在机制。本课题研究结果有望为克服神经肢质瘤替莫唑胺耐药提供新的有效方法。目的研究DNMT1通过miR-20a调控胶质瘤细胞替莫唑胺耐药性的分子机制。方法采用替莫唑胺长期浓度梯度递增法建立人脑胶质瘤替莫唑胺耐药模型细胞株(U251/TMZ),并检测耐药细胞株的相关耐药基因表达水平确定耐药性。在体外实验胶质瘤细胞(U251)水平和在体内实验模式动物(裸鼠)水平分别研究验证DNMT1通过调节miR-20a表达对其靶基因LRIG1和其下游信号通路的影响而参与肢质瘤替莫唑胺耐药的机制。结果(1)人脑胶质瘤替莫唑胺耐药细胞株(U251/TMZ)成功建立,具有稳定的耐药性。(2)U251/TMZ细胞株中DNMT1的表达水平明显低于正常U251细胞株,而miR-20a表达水平明显高于正常U251细胞株。(3)DNMT1通过调节miRNA-20a基因启动子甲基化水平来调节miR-20a和LRIG1的表达。(4)miR-20a-LRIG1轴是DNMT1参与肢质瘤细胞替莫唑胺耐药的下游信号靶点。(5)DNMT1-miR-20a-LRIG1 轴调控 EGFR/AKT/mTOR信号通路活性。结论:在体外和体内实验均证明DNMT1通过调节miRNA-20a基因启动子甲基化水平来调节miR-20a表达,继而调控LRIG1的表达,并且通过miR-20a/LRIG1调控下游EGFR/AKT/mTOR信号通路参与肢质瘤细胞替莫唑胺耐药的调节机制。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41
【参考文献】
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，本文编号：1658676
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