静电纺丝对RSC96细胞生物学行为的影响

发布时间：2018-03-25 06:06

本文选题：雪旺细胞　切入点：RSC96细胞　出处：《南方医科大学》2014年博士论文

【摘要】：研究背景：周围神经损伤在全世界范围内发生率及致残率都很高。在周围神经损伤众多类型中,神经干的横断性损伤,特别是造成较长神经节段缺损的患者预后不好,为了促进神经再生和功能恢复,往往选用外科的重建手术。因此如何修复损伤的周围神经成为了神经科学研究中的一个重大的挑战。在周围神经发生离断性损伤时,断端远侧部分和近侧1-2个轴突和髓鞘发生一系列的分子和细胞学事件,即我们通常所说的华勒变性,导致轴浆微管和神经纤维管的连续性遭到破坏。24小时后断端远侧的轴突发生变性、解体；48小时后髓鞘开始破坏。然后巨噬细胞和单核细胞迁移到变性神经断端附近清除髓鞘和轴突的残渣,与此同时雪旺细胞增殖形成Bunger带。在雪旺细胞分泌的神经营养因子和细胞外基质的影响下,损伤近端的神经纤维芽生出一个被基底膜围绕的再生单位。新的轴突芽生往往从朗飞氏结开始并被雪旺细胞重新髓鞘化。功能性的支配需要再生的轴突在生长圆锥的引导下延伸至突触的终末器官,在人类,轴突再生速度约2-5mm/天,因此一些重大的损伤的恢复可能需要几个月。为了帮助周围神经损伤的修复,早在17世纪就进行了临床干预。到了19世纪和20世纪,外科技术取得了巨大的进步,被广泛地应用于周围神经损伤的诊疗中。尽管在外周神经损伤的外科修复取得了很大的进步,但自体神经的移植一直被认为是金标准。尽管如此,自体神经移植也有自己的缺陷如：供体神经的有限性,需要进行二次手术等。另外,采用这种方法也仅能恢复原有功能的80%。因此寻找更有前途的方法是周围神经修复一个巨大的挑战。近年来,陆续出现了不同类型的生物或人工移植物,并不乏拿这些移植物与自体神经移植进行比较的研究。组织工程,作为一个新兴的领域,这些年来蓬勃发展。这些给神经科学家和外科医生合作发展组织工程神经移植物提供了契机。与其它组织工程产物类似,组织工程神经移植物也是由物理支架并导入支持细胞和(或)生长因子或其它的生物分子。随着周围神经修复中组织工程神经移植物的应用,周围神经系统中的主要胶质细胞即雪旺细胞也越来越受到重视。在周围神经系统的发育过程中,雪旺细胞沿着轴突生长的方向迁移并在轴索的前方,首先包裹几个轴突,最终仅仅包绕一个轴突节段。当周围神经损伤时,雪旺细胞增殖,产生生长因子,清除残渣,并且为轴突的再生提供指引和支持。另外,体外实验证实平行排列的活体和离体雪旺细胞都能促进轴突生长。因为在周围神经损伤修复中的重要作用,雪旺细胞在治疗中的作用越来越受到重视。最近已经得到证实,神经组织工程移植物,特别是神经诱导管道需要移植支持细胞如雪旺细胞才能促进神经修复。雪旺细胞起源于神经嵴,发育最终形成周围神经系统中形成髓鞘的雪旺细胞和无髓鞘形成雪旺细胞,分别包绕粗和细的轴突。在形成雪旺细胞之前,还经过了另外两种细胞类型,一种是雪旺细胞前体,这种细胞是14-15天胚胎鼠中的胶质细胞类型；另一种是不成熟的雪旺细胞,这种细胞是由雪旺细胞前体产生的,是17-18天胚胎鼠(大约是出生时)中的胶质细胞类型。出生后的不成熟雪旺细胞发育主要跟它随机包绕的轴突有关系,只有在包绕粗的轴突时才能形成髓鞘。整个发育过程可以分为三个阶段：从神经嵴干细胞到雪旺细胞前体；从雪旺细胞前体到不成熟的雪旺细胞；从不成熟的雪旺细胞到两种成熟雪旺细胞类型。这一系列的过程都受到与细胞相联系的轴突信号的调控。体内的细胞生活在一个复杂的微环境中,既受到化学因素也受到物理因素的影响,其中微环境中的拓扑结构往往以物理因素的形式影响细胞行为。尽管在不同细胞系统生物化学的影响已经得到详尽的证实,但我们对于物理因素怎样影响细胞的行为尚处于懵懂状态。1934年,Formalas发明了用静电力制备聚合物纤维的实验装置并申请了专利,其专利公布了聚合物溶液如何在电极间形成射流,这是首次详细描述利用高压静电来制备纤维装置的专利,被公认为是静电纺丝技术制备纤维的开端。但该技术发展较缓慢,科研人员大多集中在静电纺丝装置的研究上,发布了一系列的专利,但是尚未引起广泛的关注。直到近年来,随着纳米技术的发展静电纺丝技术获得了快速发展,通过静电纺丝技术制备纳米纤维材料是近十几年来世界材料科学技术领域的最重要的学术与技术活动之一。静电纺丝并以其制造装置简单、纺丝成本低廉、可纺物质种类繁多、工艺可控等优点,已成为有效制备纳米纤维材料的主要途径之一。静电纺丝因能模拟体内微环境,因此被广泛应用于制造纳米纤维支架。RSC96细胞株是大鼠雪旺细胞经过原代细胞培养自然转化而成,是一种较理想的类Schwann细胞,本实验首先对该细胞系和原代雪旺细胞的生物学性状进行了比较,然后在此研究基础上以RSC96细胞为模型来探讨静电纺丝对RSC96细胞生物学性状的影响。目的： 1.对比了原代培养的雪旺细胞与RSC96细胞生物学行为。 2.制备不同空间排列的静电纺丝和粗细不同的平行静电纺丝。 3.研究不同空间排列的静电纺丝对RSC96细胞生物学行为的影响。 4.初步探索粗细不同的平行排列静电纺丝对RSC96细胞生物学行为的影响。方法 1.取1～3天龄SD乳鼠的双侧的坐骨、臂丛神经,D-Hank's液冲洗2次,解剖显微镜下仔细剥除神经外膜,D-Hanks液反复冲洗2次,剪碎至1mm3大小的组织块,双酶消化法进行分离培养,阿糖胞苷抑制成纤维细胞生长,后加入含Forsoklin和牛脑垂体浸提物的培养液来选择性促进雪旺细胞的生长,最后传代进一步纯化,光镜下进行形态学观察。常规复苏培养RSC96细胞。隔天换液,待细胞融合率为80%时用胰蛋白酶消化传代,光镜进行形态学观察。胰蛋白酶消化收集两种细胞,进行以下实验：1)用Trizol法提取细胞总RNA,用Oligo(dT)逆转录酶得到cDNA。经特定引物PCR扩增,取相同量的逆转录产物进行qPCR反应；qPCR反应采用SYBR Green/ROX qPCRMaster Mix(2X),按照说明书在冰上配制PCR反应液,每个样品重复3次。反应结束后确认PCR反应的扩增曲线和溶解曲线,采用2-ΔΔcT法确定特定荧光域值对应循环数的Ct值,对目标基因定量。2)按照细胞总蛋白分离试剂盒说明书进行分离提取各组细胞的蛋白。用Bradford Protein Assay Kit试剂盒测定蛋白含量。取等量样品总蛋白与等体积2×SDS凝胶上样缓冲液混匀,100℃加热煮沸10min,经SDS-PAGE凝胶电泳分离。用湿电转移法将蛋白转移至PVDF膜上,分别采用抗NGF,抗Laminin和抗(3-actin一抗孵育2h,三次洗膜后,加入HRP-偶联二抗,进行免疫反应,化学发光法检测条带。条带信号强度应用Image J图像分析软件进行分析。 2.直径较细的平行排列的静电纺丝纤维制备：将6-氟异丙醇溶解的10%的聚己内酯在电压为10kv的静电纺丝仪上以4m1/h速度纺成纺丝,用2800rpm的取向接收器接收。随机排列的静电纺丝纤维制备：将6-氟异丙醇溶解的10%的聚己内酯在电压为10kv的静电纺丝仪上以3ml/h速度纺成纺丝,用200rpm接收器接收。在制备上述两种不同空间排列的静电纺丝时,注射器喷头和接收器之间的距离分别是15cm和13cm。直径较粗的平行排列的静电纺丝纤维制备：将二氯甲烷和甲醇混合液溶解的15%的聚己内酯在电压为10kv的静电纺丝仪上以3m1/h速度纺成纺丝,用2800rpm的取向接收器接收。注射器喷头和接收器之间的距离是10cm。 3.RSC96细胞常规复苏后24h换液,2-3d传代扩增,扩增培养24小时后接种于PCL材料上,并进行分组,对照组A：平行排列的静电纺丝上接种培养RSC96细胞。实验组B：随机排列的静电纺丝上接种培养RSC96细胞。实验组C：PCL膜直接接种培养RSC96细胞。各组接种细胞数量相同。各组细胞于37℃含5%CO2的培养箱中培养3天(期间换液1次)后,进行以下实验：1)按照细胞总蛋白分离试剂盒说明书进行分离提取各组细胞的蛋白。用Bradford Protein Assay Kit试剂盒测定蛋白含量。取等量样品总蛋白与等体积2×SDS凝胶上样缓冲液混匀,100℃加热煮沸10min,经SDS-PAGE凝胶电泳分离。用湿电转移法将蛋白转移至PVDF膜上,分别采用抗NGF,抗Laminin和抗β-actin一抗孵育2h,三次洗膜后,加入HRP--偶联二抗,进行免疫反应,化学发光法检测条带。条带信号强度应用Image J图像分析软件进行分析。2)用Trizol法提取细胞总RNA,用Oligo(dT)逆转录酶得到cDNA。经特定引物PCR扩增,取相同量的逆转录产物进行qPCR反应；qPCR反应采用S YBR Green/ROX qPCRMaster Mix(2X),按照说明书在冰上配制PCR反应液,每个样品重复3次。反应结束后确认PCR反应的扩增曲线和溶解曲线,采用2-ΔΔCT法确定特定荧光域值对应循环数的Ct值,对目标基因定量。 4.RSC96细胞常规复苏后24h换液,2-3d传代扩增,扩增培养24小时后接种于PCL材料上,并进行分组,对照组A：六孔板空白孔内直接接种培养RSC96细胞。实验组B：直径较细平行静电纺丝上接种培养RSC96细胞。实验组C：直径较粗平行静电纺丝上接种培养RSC96细胞。各组接种细胞数量相同。各组细胞于37℃含5%CO2的培养箱中培养3天(期间换液1次),用Trizol法提取细胞总RNA,用Oligo(dT)逆转录酶得到cDNA。经特定引物PCR扩增,取相同量的逆转录产物进行qPCR反应：qPCR反应采用SYBR Green/ROX qPCRMaster Mix(2X),按照说明书在冰上配制PCR反应液,每个样品重复3次。反应结束后确认PCR反应的扩增曲线和溶解曲线,采用2-ΔΔCT法确定特定荧光域值对应循环数的Ct值,对目标基因定量。结果 1.光镜下观察,雪旺细胞胞体呈双极纺锤形,周缘有亮带,胞核呈卵圆形或长圆形,细胞两极有长短不等的突起,细胞间常有端对端、肩并肩排列,排列呈放射状或巢状；RSC96细胞呈现典型的双极纺锤形或多角形,绝大多数细胞伸出长突起,其生长形态与原代雪旺细胞非常相似；qPCR和Western blot结果发现体外培养的RSC96细胞也可表达NGF及Laminin,与原代雪旺细胞相似。 2.运用不同静电纺丝接收装置,制备了直径相似但空间排列不同的两组静电纺丝；通过对纺丝溶液浓度和毛细喷丝头与接收仪器间距离的调控,制备了直径不同但同为平行排列的两组静电纺丝。 3.平行、随机静电纺丝及膜上培养RSC96细胞NGF和Laminin基因的表达及蛋白含量：3组细胞培养3天,后两组的RSC96细胞NGF基因的扩增表达量较多,相比第一组有很明显的差异,差异有统计学意义(P0.05),后两组之间明显差异；3组细胞均有Laminin基因扩增表达,且呈递减趋势,各组之间差异有统计学意义(P0.05)。各组细胞蛋白条带显示均有NGF和Laminin的表达,其中各组NGF蛋白的表达明显差异,且有统计学意义(P0.05)；各组Laminin蛋白的表达呈递减趋势,各组之间差异有统计学意义(P0.05)。 4.培养在粗细不同的平行静电纺丝上及空白对照组的RSC96细胞NGF和Laminin蛋白表达：3组细胞培养3天,后两组的RSC96细胞NGF基因的扩增表达量较少,相比第一组有很明显的差异,差异有统计学意义(P0.05),后两组之间无明显差异(P0.05)；3组细胞均有Laminin基因扩增表达,且呈递增趋势,各组之间差异有统计学意义(P0.05)。结论 1.发现体外培养的RSC96细胞生长形态与原代雪旺细胞非常相似；也可表达神经营养因子及层粘连蛋白,是一种较理想的原代雪旺细胞替代品,避免了长周期且繁杂的原代雪旺细胞培养及雪旺细胞纯度不高和长期培养雪旺细胞功能不佳等不足。 2.通过控制静电纺丝工艺中的相关因素如：纺丝溶液浓度、接收装置不同及毛细喷丝头与接收仪器间距离分别制备了两种不同空间排列即平行和随机排列的PCL静电纺丝及粗细不同的平行的PCL静电纺丝。 3.将RSC96细胞培养在不同空间排列的静电纺丝上,检测RSC96细胞神经生长因子及层粘连蛋白的表达差异,发现平行排列的静电纺丝纤维抑制神经生长因子的表达,却促进层粘连蛋白的表达,从而进一步说明了平行排列的静电纺丝纤维可能有类似与轴突的作用,并可能促进RSC96细胞向更成熟的形态发育。 4.初步探讨了将RSC96细胞培养在不同直径的平行排列静电纺丝上,检测RSC96细胞NGF及Laminin基因表达差异,发现直径较粗的平行静电纺丝纤维Laminin的表达较多,有统计学意义。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R745

【参考文献】