基于髓过氧化物酶的炎症分子成像及荧光示踪小鼠T淋巴细胞的实验研究

发布时间：2018-03-25 04:20

本文选题：分子影像　切入点：炎症　出处：《复旦大学》2014年博士论文

【摘要】：分子影像(Molecular Imaging)是指通过影像学的方法,无创性的检测细胞和(或)分子水平的主要事件,了解体内特异性基因或者蛋白表达部位、水平、分布及持续的时间。分子影像的发展主要依赖以下条件的发展：1.具有临床意义的靶点；2.适合靶点的分子探针及适当的信号放大机制；3.高敏感度及分辨率的成像设备或混合成像设备。分子影像的靶点需要是机体有意义的生理及病理情况下大量表达的某种物质。神经炎症由于参与多种中枢神经系统疾病,一直是分子影像靶点探索和成像研究的热点之一。神经炎症是指神经系统在感染,创伤,中毒或自身免疫启动等情况下,循环的外周免疫细胞跨越抵抗力减弱的血脑屏障(Blood-brain barrier, BBB),释放多种酶来诱导并参与的炎症过程。髓过氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)是参与炎症反应的酶中比较关键的一种,是许多活化了的白细胞强有力的炎性介质。MPO以氯离子和中性粒细胞产生的过氧化氢为底物,催化产生次氯酸和多种自由基。如果机体不能有效清除这些氧化剂和自由基,便引起多种病理过程和组织损伤。因此,MPO的活性可以反映神经炎症活动性,可以作为示踪神经炎症参与的中枢神经系统疾病活动性的成像靶点。分子探针是指底物与能产生影像学信号的物质以特定方法结合而构成的一种复合物。目前,分子探针大多为靶向性探针,利用特异性探针与靶目标结合而成像,主要用于感兴趣分子的在体分布情况的显示。其中,可激活的探针,又称为智能探针,由于探测或参与特异的分子事件并被激活而成像,对分子事件具有很好的特异性,并达到对靶事件的功能性显示。对于探针的检测,各种设备各有利弊。磁共振成像(Magnetic resonance imaging, MRI)具有很高的空间分辨率,适用于中枢神经系统疾病的探索,但其检测敏感性较低,需要大量对比剂在靶组织内聚集及强大的信号扩增系统。与此相比,光学分子成像具有敏感性高、可实时成像等优点,且无创伤、价格低,可对磁共振成像信息进行补充。本研究拟以神经炎症中的关键酶MPO为靶点,构建MPO可特异性激活的磁共振智能探针及荧光智能探针,并对其在示踪中枢神经系统活动性炎性病灶的应用进行研究。且拟利用荧光成像对淋巴细胞的进行体外示踪初步探讨,为多模态成像奠定基础。第一部分靶向MPO的磁共振成像评估多发性硬化联合治疗的动物模型研究目的：醋酸格拉默(Glatiramer acetate, GA)通过产生免疫抑制性Th2淋巴细胞被用于治疗MS; 4-Aminobenzoic acid hydrazide (ABAH)是一种特异性MPO酶活性抑制剂。本研究拟以MPO为靶点,通过MPO特异性分子探针磁共振成像评估两种药物联合治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)动物模型的疗效。材料与方法：SJL小鼠皮下注射髓鞘蛋白脂质蛋白(Proteolipidprotein, PLP)诱导EAE模型小鼠110只。记诱导当天为第0天,急性期为第10天,追踪至第20天。小鼠随机分为4组,生理盐水对照组200 μL, bid (n= 5), ABAH组20mg/kg, bid (n= 30), GA 75μg, qd组 (n=30)及ABAH 20mg/kg, bid及GA75μg,qd联合治疗组(n=40)。5只假手术小鼠经同样方式诱导,但用PBS代替PLP。每天2次进行临床评分评估,并观察小鼠生存率。合成MPO可特异性激活的智能探针bis-5HT-DTPA-Gd (MPO-Gd),选择急性期不同治疗组小鼠行磁共振T1WI平扫及增强扫描。结合平扫及增强后60min图像分析病灶的数目,病灶体积及病灶对比噪声比。成像小鼠行HE,抗MPO及坚考蓝染色,评估病灶的炎性浸润,MPO表达及脱髓鞘程度。统计采用Student's t-test, P0.05视为有统计学差异。结果：EAE小鼠模型诱导成功。观察至急性期,可见联合治疗组小鼠发病晚,且疾病严重程度明显轻于单药治疗组(ABAH P0.001, GA P0.05)。观察至第20天,综合整个疾病进程,联合治疗组临床评分低,且疾病严重程度明显轻于单药治疗组(ABAH P0.05, GA P0.05),生存率也高。在急性期成像,分析不同治疗组小鼠的平扫及MPO-Gd增强6Omin影像结果显示,联合治疗组的病灶数目减少(ABAH P0.01, GA P0.05),病灶的体积明显减小(ABAH P0.05,GAP0.05)；对比噪声比也明显减低(ABAH P0.01, GA P0.05)。病理结果同样显示联合治疗组脑内炎性细胞的浸润,MPO的表达及髓鞘破坏的程度均减低。结论：本部分实验证实了GA与ABAH低剂量联合治疗较单药治疗效果好。以MPO为靶点的MPO-Gd智能探针MR成像通过示踪脑内活动性病灶,准确反映这一疗效,同临床表现及病理结果相符。第二部分髓过氧化物酶特异性荧光探针的特性探索及初步应用目的：基于MPO-Gd分子探针合成原理,为扩展MPO为靶点的分子成像应用范围,本实验拟合成一种MPO可激活的酶活性智能荧光探针,并对其在体内外靶向炎性病变的特性及应用进行初步探索。材料与方法：以5-羟色胺(5-Hydroxy tryptmamine,5-HT)为底物,接以生物素基团合成MPO可激活的荧光探针,进而通过接以荧光基团的链酶亲和素同探针中生物素的特异性结合对MPO进行成像。体外,包埋及未包埋人MPO的基质胶铺于96孔板中,按顺序分别加入荧光探针,清洗；加入不同浓度链酶亲和素荧光复合物,清洗,对基质胶行荧光成像。在体,将包埋不同浓度人MPO的基质胶注入小鼠皮下,并尾静脉分别注入MPO探针及链酶亲和素荧光复合物。肺炎链球菌皮下注射制作小鼠皮下细菌感染模型,同样经尾静脉注入MPO探针和链酶亲和素荧光复合物,并皮下注入Sytox Green绿色荧光蛋白来检测局部炎性粒细胞凋亡情况。以上动物模型分别在注入荧光探针后0,15,30,45,60min行荧光成像。沙门氏杆菌脊髓鞘内注射制作小鼠脑膜炎感染模型,分离脑单个核细胞行流式细胞术分析脑内髓系细胞浸润情况,并取脑组织分析MPO活性。同样尾静脉注入MPO探针和链酶亲和素荧光复合物,60min后取脑组织,离体荧光成像。结果：MPO特异性荧光探针可以成功合成。体外基质胶实验荧光成像可见MPO阴性的基质胶荧光成像为阴性,而MPO阳性的基质胶内各孔可见荧光强度升高,且升高程度同链酶亲和素荧光复合物的浓度趋势相同。说明MPO探针可被激活并发生局部寡聚化,且生物素-链酶亲和素两步法荧光成像可行。小鼠皮下包埋MPO基质胶成像可见MPO阳性基质胶部位荧光强度明显升高,且信号的强度升高趋势同MPO浓度升高趋势相关(r2=0.9572)。肺炎链球菌皮下感染小鼠的60min荧光成像可见MPO探针可靶向聚集到感染部位,呈现红色荧光,同局部凋亡中性粒细胞的绿色荧光相吻合,说明局部激活的炎性细胞凋亡,释放MPO并可被MPO荧光探针检测到。鞘内注射沙门氏杆菌的脑膜炎小鼠造模后24小时,流式细胞术分析可见脑内存在大量髓系细胞的浸润。病变脑MPO活性结果显示脑膜炎小鼠脑内MPO活性明显升高,说明脑膜炎小鼠建模成功。模型小鼠脑组织离体荧光成像可见病变脑膜呈明显条状强化,而正常鼠脑未出现此强化。说明MPO探针可跨越血脑屏障,为中枢的MPO激活而显像。结论：本部分实验中,我们成功合成一种新的MPO可以激活的酶活性荧光探针,其同链酶亲和素荧光复合物两步法成像可行。体外及在体(中枢及外周)荧光成像表明此探针可特异性靶向MPO存在部位,进而对活动性炎性病灶成像。第三部分荧光示踪细胞毒性T淋巴细胞免疫治疗胶质瘤初探目的：利用荧光成像的高敏感性优势,本研究拟通过对小鼠T淋巴细胞表面生物素化,通过链酶亲和素荧光复合物间接对T淋巴细胞靶向生物素化胶质瘤干细胞进行体外荧光示踪,并对其特异性靶向杀伤作用进行初步探索。材料与方法：小鼠脾脏阳性选择分离CD8阳性T淋巴细胞并刺激增殖1-2天,得到激活的细胞毒性T淋巴细胞。慢病毒转染法激活的细胞毒性T淋巴细胞进行生物素化并分析转染效率。Sulfo-NHS-生物素对激活的细胞毒性T淋巴细胞进行表面蛋白共价结合法生物素化,并分析至72小时时的标记效率及T淋巴细胞存活率。通过慢病毒转染的方法对胶质瘤干细胞进行细胞表面生物素化,并生物荧光素酶转染观察荧光素酶分泌情况。将生物素化的胶质瘤干细胞同激活的T淋巴细胞体外共培养24小时,观察杀伤效果。统计学采用Student's t-test, P0.05视为有统计学差异。结果：慢病毒转染法生物素化细胞毒性T淋巴细胞效率较低(15.50±3.027%),且细胞损伤严重。而共价结合细胞表面生物素化的方法可以对激活的T淋巴细胞高效标记(98.36±0.6129%)。体外通过流式分析术可以敏锐检测到标记以链酶亲和素荧光探针的激活的T淋巴细胞,且检测到生物素化的T淋巴细胞72小时以内活性不受影响并细胞标记不丢失。胶质瘤干细胞可以被慢病毒成功转染,细胞表面表达生物素效率较高,且细胞存活良好。体外T淋巴细胞同肿瘤细胞共培养结果表明以链酶亲和素为桥梁的靶向组T淋巴细胞杀伤肿瘤效果最好,肿瘤形态发生明显改变,肿瘤表达荧光量降低,且可见标记以荧光探针的T淋巴细胞聚集于肿瘤群落周围。利用生物荧光素酶检测胶质瘤干细胞的生长分泌情况发现,相对于对照组及非靶向组,靶向组肿瘤生长受到明显抑制(对照组P0.001；非靶向组P0.01)结论：本研究中利用共价结合表面生物素化并链酶亲和素荧光复合物成功实现了细胞毒性T淋巴细胞靶向生物素化胶质瘤的体外荧光示踪。链酶亲和素增强细胞毒性T淋巴细胞对生物素化胶质瘤干细胞的靶向及杀伤作用。展望：实现MRI同荧光成像结合的双模态成像。为实现细胞毒性T淋巴细胞免疫治疗胶质瘤中细胞示踪并复杂肿瘤免疫微环境的监测,可通过细胞表面荧光标记实现细胞毒性T淋巴细胞体内荧光示踪；结合MPO-Gd增强图像来评价T淋巴细胞免疫治疗后胶质瘤周围炎性免疫微环境的变化,综合评价免疫治疗的疗效并进行机制研究。总之,本研究中,我们合成了MPO特异性磁共振智能探针和荧光智能探针；通过MPO可激活的智能探针,将MPO作为一个敏感的成像靶点对中枢及外周的活动性炎性病灶成像可行；通过T淋巴细胞表面生物素化,借助链酶亲和素荧光复合物实现T淋巴细胞靶向生物素化胶质瘤干细胞的体外荧光示踪并监测杀伤效果；为多模态成像评估复杂生物分子事件奠定基础。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R741;R445.2

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