核因子-κB介导糖尿病性痛觉过敏的分子和表观调控机制研究

发布时间：2018-03-27 20:04

本文选题：糖尿病　切入点：痛觉过敏　出处：《苏州大学》2015年博士论文

【摘要】：研究背景糖尿病神经病变是糖尿病最常见也是最易致残的慢性并发症之一,其发生率根据诊断标准和检测方法的不同,患病率在10%~96%不等(中国2型糖尿病防治指南2013版)。其最常见的类型是周围神经病变,其次为糖尿病自主神经病变。周围神经病变常表现为远端肢体对称性的麻木感,部分患者会出现异常疼痛,包括自发痛、痛觉过敏(轻度刺激引起剧烈疼痛)和痛觉超敏(无害刺激如光照、触摸时也能引起明显疼痛)等,称为糖尿病神经病理性疼痛。而自主神经病变主要影响心血管、胃肠及泌尿生殖系统功能。当累及上消化道时,常导致患者出现上腹痛或不适、恶心呕吐、反酸烧心、餐后饱胀等一系列症状,同时具有胃部痛觉过敏现象,表现为胃对胃酸、炎症或扩张等刺激的反应性明显增加。目前糖尿病神经病变的发病机理尚未完全阐明,亦缺乏有效的临床治疗手段,显著影响着糖尿病患者的生活质量。进一步研究其机制,对于寻找有效的治疗靶点非常重要。第一部分1.研究目的阐明核因子-κB在糖尿病胃部痛觉过敏形成中的作用及相关机制,主要研究内容包括:(1)探讨糖尿病大鼠是否存在胃部痛觉过敏及其相关电生理机制。(2)探讨CBS-H2S系统是否参与糖尿病大鼠胃部痛觉过敏的形成。(3)探讨NF-κB对CBS-H2S系统的调控作用及相关机制。2.实验方法(1)选用雌性成年SD大鼠作为实验动物,应用STZ(65mg/kg)腹腔单次注射诱导糖尿病模型。应用胃部球囊扩张及肌电图分析技术,检测大鼠的胃部感觉。(2)应用全细胞膜片钳技术记录大鼠胃特异性DRG神经元的兴奋性及硫化氢对胃特异性DRG神经元兴奋性的影响。(3)应用Real-time PCR和Western blotting方法检测大鼠胃特异性DRG中NF-κB、硫化氢合成酶CBS、DNA甲基化相关酶的表达水平。(4)应用甲基化特异性PCR(MSP)和亚硫酸氢盐处理测序法(BSP)检测大鼠胃特异性DRG神经元中cbs基因启动子区的甲基化状态。(5)应用免疫荧光染色法观察NF-κB与CBS在胃特异性DRG神经元上的表达情况。(6)应用染色质免疫共沉淀(CHIP)法检测大鼠胃特异性DRG中NF-κB与cbs基因启动子区的结合度。3.实验结果(1)STZ腹腔注射后2-6周糖尿病大鼠出现明显的胃部痛觉过敏,第4-6周痛敏最为明显。STZ注射后第4周,糖尿病大鼠胃特异性DRG神经元兴奋性明显增加。(2)糖尿病大鼠胃特异性DRG中CBS表达增加。腹腔注射CBS抑制剂AOAA能够缓解糖尿病大鼠胃部痛觉过敏,并呈剂量依赖性。腹腔注射AOAA能够降低糖尿病大鼠胃特异性DRG神经元的兴奋性。H2S衍生剂Na HS能够增加DRG神经元兴奋性。(3)NF-κB与CBS共表达于大鼠胃特异性DRG神经元中,糖尿病大鼠胃特异性DRG中NF-κB与cbs基因启动子区结合度增加。腹腔注射NF-κB抑制剂PDTC能够下调糖尿病大鼠胃特异性DRG中CBS的表达。糖尿病大鼠胃特异性DRG中cbs基因启动子区明显去甲基化,DNA甲基转移酶3a、3b表达下调。4.小结(1)糖尿病大鼠存在胃部痛觉过敏,并与胃特异性DRG神经元兴奋性增加有关;(2)糖尿病状态下,胃特异性DRG神经元中CBS的表达上调,增加H2S的合成,致敏神经元,参与糖尿病胃部痛觉过敏的形成;(3)糖尿病状态下,活化的NF-κB可以在转录水平上调CBS的表达;cbs基因启动子区去甲基化增强,使得NF-κB与cbs基因启动子区的结合成为可能,并发挥其转录调控作用。第二部分1.研究目的阐明核因子-κB在糖尿病后肢痛觉过敏形成中的作用及相关机制,主要研究内容包括:(1)探讨转录因子NF-κB是否参与糖尿病大鼠后肢痛觉过敏的形成。(2)探讨配体门控通道P2X3受体是否参与糖尿病大鼠后肢痛觉过敏的形成。(3)探讨NF-κB对P2X3受体的调控作用及相关机制。2.实验方法(1)选用雌性成年SD大鼠作为实验动物,应用STZ(65mg/kg)腹腔单次注射诱导糖尿病模型。应用Von frey filament(VFF)和热刺激仪定量检测大鼠的后肢痛觉阈值。(2)应用全细胞膜片钳技术记录大鼠后肢特异性DRG神经元ATP诱导的的电流密度。(3)应用Real-time PCR和Western blotting方法检测大鼠后肢特异性DRG中NF-κB、P2X3(及P2X1,P2X2)、DNA甲基化相关酶的表达水平。(4)应用甲基化特异性PCR(MSP)和亚硫酸氢盐处理测序法(BSP)检测大鼠后肢特异性DRG神经元中p2x3基因启动子区的甲基化程度。(5)应用免疫荧光染色法观察NF-κB与P2X3在后肢特异性DRG神经元上的表达情况;观察携带GFP的慢病毒对后肢特异性DRG神经元的转染情况。(6)应用染色质免疫共沉淀(CHIP)法检测大鼠后肢特异性DRG中NF-κB与p2x3基因启动子区的结合度。3.实验结果(1)STZ腹腔注射后2周大鼠出现后肢机械痛敏及热痛敏,并至少持续至第9周,第4-6周痛敏最为明显。STZ注射后第4周,糖尿病大鼠后肢特异性DRG中NF-κB表达增加。腹腔注射NF-κB抑制剂PDTC或鞘内注射NF-κB si RNA慢病毒均能够缓解糖尿病大鼠的后肢机械痛敏和热痛敏。(2)鞘内注射P2受体拮抗剂suramin或P2X3受体拮抗剂A-317491均能缓解糖尿病大鼠后肢痛觉过敏,并呈剂量依赖性。糖尿病大鼠后肢特异性DRG中P2X3受体表达增加(而非P2X1或P2X2)。糖尿病大鼠后肢特异性DRG神经元ATP诱导的电流密度明显增加。(3)NF-κB与P2X3受体共表达于大鼠后肢特异性DRG神经元中,糖尿病大鼠后肢特异性DRG中NF-κB与p2x3受体基因启动子区结合度增加。鞘内注射NF-κB si RNA慢病毒能够下调糖尿病大鼠后肢特异性DRG中P2X3受体的表达,并降低ATP诱导的电流密度。糖尿病大鼠后肢特异性DRG中p2x3受体基因启动子区明显去甲基化,DNA甲基转移酶3b表达下调。4.小结(1)NF-κB参与糖尿病大鼠后肢痛觉过敏的形成;(2)糖尿病状态下,后肢特异性DRG神经元中P2X3受体的表达及功能增加,参与糖尿病大鼠后肢痛觉过敏的形成;(3)糖尿病状态下,活化的NF-κB可以在转录水平调控P2X3受体的表达;p2x3基因启动子区域去甲基化,使得NF-κB与p2x3基因启动子区的结合成为可能,并发挥其转录调控作用。结论(1)糖尿病大鼠存在胃部痛觉过敏及后肢痛觉过敏,并分别与各自特异性DRG神经元的敏化有关。(2)NF-κB分别通过调控痛相关基因(cbs和p2x3)的表达,致敏胃特异性及后肢特异性DRG神经元,导致胃部痛觉过敏及后肢痛觉过敏。(3)DNA甲基化参与NF-κB对痛相关基因cbs及p2x3的表达调控。
[Abstract]:Objective To study the role of NF - 魏B in the pathogenesis of diabetic neuropathy . ( 2 ) To investigate the effect of NF - 魏B on gastric pain in diabetic rats . ( 1 ) The expression of NF - 魏B and cbs gene promoter region in diabetic rats was significantly increased by intraperitoneal injection of AOAA . ( 4 ) The expression of p2x3 gene promoter in hind limb specific DRG of diabetic rats was increased . The expression of P2X3 receptor in hind limb specific DRG of diabetic rats was increased . ( 3 ) The expression of P2X3 receptor in hind limb specific DRG of diabetic rats was increased . ( 3 ) NF - 魏B and P2X3 receptor antagonist A - 317 491 could regulate the expression of P2X3 receptor in hind limb specific DRG of diabetic rats .

【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2;R747.9

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