sPMCA体系中辅助因子及相关物理条件对朊蛋白构象转变的影响
本文选题：朊病毒 切入点：脂 出处：《华东师范大学》2015年博士论文
【摘要】：传染性海绵状脑病又称为朊病毒疾病是一种广泛地存在于人类和动物中具有传染性、散发性或遗传性的神经退行性疾病。“朊病毒假说”认为它的病原体是一种不含核酸的蛋白质——朊蛋白。其致病性和传染性是由于富含α螺旋的正常朊蛋白构象转变为β折叠的致病构象。脂因其独特的生物物理特性成为朊蛋白构象转变的重要辅助因子。它与朊蛋白通过静电力吸引,后与其疏水区结合,使其跨越能量屏障增加β折叠,并具有抵抗蛋白酶K消化的能力。故朊蛋白在疏水环境中构象的变化是朊蛋白形成致病构象非常重要的一环。本文首次使用甲醇、乙醇、正丙醇模拟疏水环境,通过圆二色谱、蛋白酶K消化、超高速离心来观察重组朊蛋白在疏水环境中二级结构的变化、抵抗蛋白酶K的能力、朊蛋白聚集化的情况。我们发现随着环境疏水性的增加,重组朊蛋白α螺旋减少。在蛋白酶K酶活无差异的情况下,疏水环境中的重组朊蛋白不能被完全消化酶解,并出现可溶的具有蛋白酶K抗性的构象。在朊病毒构象转变的现代研究中,蛋白质错误构象循环扩增(sPMCA)技术被广泛运用。随着脂在朊蛋白构象转变中的重要性逐渐被揭示,它作为重要的辅助因子被引入sPMCA体系。使用细菌表达的重组朊蛋白,加入脂(POPG)、去垢剂(Triton)、多聚阴离子(RNA),和恒温孵育超声等物理条件共同作用构建出具有高度传染性的朊病毒。然而每一种辅助因子对朊蛋白错误构象扩增的影响并不十分清楚。我们分别将辅助因子从sPMCA底物中去除,观察在某一种辅助因子缺失的情况下,具有蛋白酶K抗性的错误构象能否持续扩增。结果显示,当sPMCA底物中缺失Triton和RNA时,错误构象不能持续扩增；而缺失POPG时,错误构象却能获得持续扩增。这表明,sPMCA体系中的各项辅助因子对具有蛋白酶K抗性的错误构象扩增具有重要作用。虽然底物中缺失了POPG,但存在Triton、能替代POPG形成一定的疏水环境,使错误构象得到扩增。俄亥俄州立大学和本实验室均通过上述sPMCA体系从无至有制备得到具有高度传染性的朊病毒,分别命名为rPrP-resOSU和rPrP-res17kD。接种rPrP-resOSU和rPrP-res17kD后小鼠的存活时间分别平均为150天和172天。本文对这两者进行了神经病理学的分析和朊病毒的生化特性分析,发现两者存在构象的差异。随后又将这两种朊病毒在同地同一物理超声环境下进行扩增,将所得朊病毒分别命名为rPrP-resOSU/ECNU和rprP-res17kD/ECNU,进行生化特性分析、动物接种实验和神经病理学分析。实验结果显示,原先具有显著差异的生化特性随着在同一环境的扩增下逐渐消失,而通过神经病理学的分析发现,原先产生差异的部分也发生了改变。由此说明,从无至有制备所得的朊病毒构象并不是唯一的,同时会随着sPMCA体系环境的改变发生构象的转变。综上,sPMCA体系的辅助因子和超声孵育等物理条件对朊蛋白构象的改变具有重要影响,进一步解析了朊蛋白构象转变的过程,证实和补充了“朊病毒假说”,具有重要意义。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.9
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，本文编号：1675362
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