HMGB1对脑卒中诱导的脑组织炎症反应和外周免疫抑制的效应及机制研究

发布时间：2018-03-31 17:32

本文选题：脑缺血再灌注损伤　切入点：高迁移率族蛋白B1　出处：《浙江大学》2014年博士论文

【摘要】：研究背景：缺血性脑卒中是发病率和致残率最高的疾病之一。缺血区血管可因再通而发生脑缺血再灌注损伤(CIRI)。CIRI诱导脑组织炎症反应和外周免疫系统抑制(SIID,以淋巴细胞数量减少,功能抑制为主要特征,其诱导感染发生率增高)双向效应,目前治疗手段有限。CIRI后,坏死神经元释放高迁移率蛋白B1(HMGB1),其是一种细胞因子样蛋白,在CIRI病理过程中发挥重要作用。前人研究表明CIRI后,小胶质细胞/巨噬细胞、中性粒细胞及T细胞等免疫细胞浸润于缺血区,参与脑组织炎症反应。已经证实,HMGB1的致炎效应,可通过作用于小胶质细胞/巨噬细胞而发挥和传递。HMGB1是否同时作用于浸润的T细胞,甚至因T细胞与巨噬细胞有交互作用而通过T细胞再间接作用于巨噬细胞,目前还不清楚。不仅如此,CIRI后,HMGB1尚可通过破损的血脑屏障进入脑脊液甚至外周血。前人研究报导,大剂量HMGB1可通过作用于树突状细胞(DCs)或者直接作用于T细胞,诱导T细胞免疫功能抑制,而脑卒中后大量入血的HMGB1,是否与外周淋巴细胞数量和功能改变有关,是否介导SIID的发生,目前尚无研究报导。研究目的：拟采用局灶性脑缺血再灌注损伤模型,应用HMGB1抑制剂Glycyrrhizin(甘草甜素),观察CIRI后,HMGB1在缺血脑组织中的定位和表达情况,脑组织炎症反应情况,以及外周器官中T细胞数量改变,同时采用T细胞缺陷动物,离体和在体观察T细胞缺陷,对HMGB1效应的影响及二者的相关性,旨在探讨HMGB1在CIRI诱导的脑组织炎症反应和外周免疫抑制中的效应及机制,为脑卒中的治疗和预后提供新靶标。研究方法：本研究首先采用野生型Sprague Dawley (SD)大鼠及CD57BL/6J小鼠,建立大脑中动脉短暂性阻塞的局灶性脑缺血再灌注损伤模型(MCAO),于再灌注后12、48及72小时,免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察HMGB1在缺血脑组织、局部神经元和小胶质细胞/巨噬细胞中的定位、表达情况。而后,于动物腹腔在MCAO再灌注后即刻及3.5小时各注射一次Glycyrrhizin,TTC染色法观察大鼠脑梗塞体积,免疫荧光染色法检测缺血区小胶质细胞/巨噬细胞和中性粒细胞浸润情况,以及流式细胞仪检测缺血大脑半球单核/巨噬细胞、淋巴细胞及其亚型CD4+、CD8+T细胞等免疫细胞的数量,以探讨HMGB1对CIRI脑组织炎症和脑损伤的效应及机制。然后,采用野生型SD大鼠及T细胞缺陷的裸大鼠,在短暂性局灶性脑缺血再灌注损伤(MCAO)及永久性电凝大脑中动脉远端的永久性局灶性脑缺血再灌注损伤(dMCAO)两种模型中,以及CD57BL/6J野生型小鼠及T、B联合缺陷的SCID小鼠MCAO模型中,以Glycyrrhizin抑制IMGB1, TTC染色法检测再灌注72小时后,动物脑梗塞体积,探讨T细胞缺陷对HMGB1脑损伤效应的影响；接着,将来源于野生型小鼠的脾细胞,过继回输给SCID小鼠,在有无Glycyrrhizin处理之下,观察脑梗塞体积变化,反向验证上述发现；另外,离体将来源于野生型与SCID小鼠的脾细胞,在刀豆蛋白A (ConA)刺激后,与神经元共培养,CCK-8试剂盒检测HMGB1有无被Glycyrrhizin抑制下,神经元的存活率,观察脾细胞对神经元的杀伤效应,进一步验证和支持T细胞缺陷对HMGB1作用的影响。接下来,采用Western-blot和ELISA分别检测MCAO后24小时脑脊液,以及MCAO后5、24、48小时血清中HMGB1水平以及Glycyrrhizin的效应,同时采用流式细胞仪,检测HMGB1有无被Glycyrrhizin抑制下,外周血和脾脏中单个核细胞总数,以及单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞及其亚型CD4+、CD8+T细胞等免疫细胞的数量,以探讨外周血高水平释放的HMGB1,与外周器官淋巴细胞数量减少的相关性。实验结果：1、免疫荧光染色显示HMGB1早在小鼠脑缺血再灌注损伤(CIRI)后12小时即从神经元胞核转移到胞浆,48小时释放至胞外同时伴NeuN+神经元数量减少；与此同时,CIRI后24小时WB检测到脑脊液和ELISA检测到血浆HMGB1高水平表达；2、免疫荧光显示CIRI后72小时脑缺血核心区CD68+小胶质细胞/巨噬细胞及MPO+中性粒细胞浸润增多,而且浸润的小胶质细胞/巨噬细胞亦表达HMGB1;3、应用HMGB1抑制剂Glycyrrhizin,TTC染色显示野生型大鼠脑梗塞体积减小,免疫荧光显示脑损伤核心区小胶质细胞/巨噬细胞和中性粒细胞浸润数量减少,NeuN+神经元数量增多,HMGB1转位和胞外释放减轻；4、流式检测显示缺血再灌注后脑损伤侧包括T细胞,CD4+、CD8+T细胞,NK, NKT及B细胞淋巴细胞数量增多,而Glycyrrhizin抑制淋巴细胞及其亚型浸润于缺血区；5、TTC显示Glycyrrhizin减小MCAO及dMCAO野生型SD大鼠以及MCAO C57小鼠脑梗塞体积,但在T细胞缺陷裸大鼠及T、B联合缺陷SCID小鼠中,其脑保护作用丧失；但SCID小鼠接受WT小鼠脾细胞过继回输,其增大的脑梗塞体积,又可因Glycyrrhizin抑制HMGB1而减小离体在WT或SCID小鼠的脾细胞与神经元的共培养体系中,Glycyrrhizin改善WT而非SCID小鼠脾细胞诱导的神经元死亡；6、Western-blot显示大鼠MCAO24小时,脑脊液HMGB1表达增高；ELISA显示MCAO后5小时,血清HMGB1水平即升高,24小时达到高峰,48小时仍持续高水平表达,Glycyrrhizin显著降低脑脊液及血清HMGB1表达水平；7、流式细胞仪检测结果显示与CIRI后缺血脑组织炎症反应加剧以及外周血释放的HMGB1水平升高相反,MCAO48小时,外周血及脾脏单个核细胞总数,T淋巴细胞,CD4+、CD8+T细胞,以及B淋巴细胞数量减少,而Glycyrrhizin抑制血清高水平HMGB1释放的同时,显著改善淋巴细胞数量的减少。结论： 1.HMGB1主要分布于正常神经元细胞核中,CIRI诱导HMGB1向细胞浆转位,并于细胞死亡后释放入脑脊液及外周血； 2. HMGB1可能通过双向效应,一方面活化浸润于脑组织的T细胞,介导缺血再灌注损伤后脑组织局部炎症反应,另一方面,通过诱导外周T细胞免疫功能抑制,介导SIID; 3. Glycyrrhizin将HMGB1作为靶标,既减轻CIRI脑组织炎症反应,又改善外周免疫抑制,从而治疗脑卒中。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R743.3

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