赖氨酸羟化酶PLOD2在乏氧诱导胶质瘤迁移与侵袭过程中的作用及机制研究

发布时间：2018-04-03 22:34

本文选题：胶质瘤　切入点：赖氨酸羟化酶　出处：《山东大学》2017年博士论文

【摘要】：研究背景胶质母细胞瘤(Glioblastomamultiforme,GBM,WHOIV级)是人类中枢系统最常见、恶性程度最高的原发性肿瘤。目前,即便在显微神经外科手术和药物治疗方面取得长足发展,但总体疗效收效甚微,胶质母细胞瘤患者的平均中位生存期仅为14个月。肿瘤细胞向周围脑实质呈浸润侵袭性生长是手术很难将其完全切除的主要原因,同时,目前也认为这种侵袭特性是对多种综合治疗方案产生抵抗的主要因素之一。然而,胶质母细胞瘤的侵袭相关分子机制至今尚未阐释清晰,因此,进一步完善侵袭相关机制的研究,对改善肿瘤治疗及患者预后都将有非常重要的临床意义。为了更深入地了解胶质母细胞瘤的侵袭相关机制,除了研究肿瘤细胞自身的特性外,还需要关注独特而又复杂的肿瘤微环境。乏氧是肿瘤微环境的显著特征之一,近年来受到越来越多的关注。目前认为乏氧与肿瘤的增殖、发生发展以及传统治疗的抵抗密切相关。乏氧可以阻止乏氧诱导因子-1α/2α(Hypoxia-induciblefactor-l/2α,HiF-1/2α)的降解,病理状态下HiF-1/2α可同持续激活的亚单位HiF-1β形成二聚体,特异性结合到基因上游乏氧调控元件上,激活相关基因的表达。因此,探究乏氧如何调节特定蛋白参与肿瘤侵袭的相关机制将有助于新的肿瘤治疗策略的研发。细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)重塑是肿瘤微环境的又一典型特征。在肿瘤进展过程中,瘤周常常出现大量的胶原蛋白沉积与交联,进而导致细胞外基质硬度增加。目前已证实,它可以促进肿瘤的浸润和远处转移。已有的报道指出,包括胶质瘤在内的多种实体瘤的细胞外基质均存在硬度增加的改变。另外,细胞外基质的主要成分--胶原纤维也与胶质母细胞瘤的血管生成以及细胞黏附密切相关。胶原纤维交联的形成需要赖氨酸羟化酶2(Procollagen-Lysine 2-Oxoglutarate 5-Dioxygenase 2,PLOD2)的翻译后修饰。依据功能不同,赖氨酸羟化酶可以分为三种不同的亚型--PLOD1、PLOD2、PLOD3。赖氨酸羟化酶PLOD1特异性结合到胶原纤维αα螺旋及中央区域,羟化修饰该区域的赖氨酸残基,PLOD 2特异性羟化端肽区域中的赖氨酸残基,而PLOD3的催化底物尚不清楚。但在胶原交联形成过程中,尤以端肽区域内的羟基化赖氨酸最为重要。在纤维性疾病中,胶原纤维的过度沉积主要是由于端肽的过度羟化及羟化赖氨酸残基形成的吡啶啉交联数目增加引起的。这种吡啶啉交联物理性质更加稳定,难以降解,而PLOD2是形成这种交联的关键催化酶。目前,PLOD2相关作用的研究在某些纤维性疾病如 Bruck Syndrome、Ehlers-Danlos Syndrome VIA 中已经报道。但PLOD2在胶质瘤中的作用尚不明确,目前仅有组织学表达分析发现,赖氨酸羟化酶PLOD2可以作为胶质母细胞瘤的一个新型生物学标志物。本课题拟在前期研究基础上,通过借助公共数据库大数据分析、临床胶质瘤标本收集以及免疫组化、天狼星红染色、ELISA、慢病毒感染、RNA干扰、裸鼠原位肿瘤种植等相关分子生物学技术,分别从患者病理资料信息及分子生物水平探讨赖氨酸羟化酶PLOD2在胶质母细胞瘤中的作用及相关机制。第一部分赖氨酸羟化酶PLOD2在胶质瘤组织中的表达情况目的明确赖氨酸羟化酶PLOD2在胶质瘤组织中的表达情况及其临床意义。方法1.借助公共数据库Oncomine Database荟萃分析不同胶质母细胞瘤患者PLOD2 mRNA表达水平2.借助公共数据库REMBRANDT Database分析PLOD2 mRNA在不同级别胶质瘤中的表达差异情况3.免疫组织化学染色检测不同级别胶质瘤患者PLOD2蛋白表达程度4.借助TCGA数据库Kaplan-Meier法绘制基因PLOD2不同表达程度患者的生存曲线结果1.PLOD2在胶质瘤中高表达并呈现病理级别依赖性特征借助公共数据库Oncomine Database广泛性地检索患者病理组织基因芯片测序结果,荟萃分析(Meta-analysis)了 7个独立胶质母细胞瘤数据库,包含876例胶质母细胞瘤。分析结果发现,同正常脑组织相比,胶质母细胞瘤患者PLOD2 mRNA 转录水平一致性地高表达(MeanDifference Ⅳ Random:1.71;95%CI:1.23-2.19;P0.001)。此外,选用数据库REMBRANDTDatabase,入选病例178例,分析PLOD2在不同级别胶质瘤中的表达程度。结果证实,胶质母细胞瘤组织中的PLOD2mRNA表达水平显著性高于正常脑组织、Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤(3倍,P0.0001)。免疫组织化学染色方法检测PLOD2在9例正常脑组织、20例Ⅱ级、20例Ⅲ级、29例Ⅳ胶质瘤(胶质母细胞瘤)中的表达情况。在正常脑组织和Ⅱ级胶质瘤中,PLOD2的免疫染色呈阴性或弱阳性;但随着肿瘤级别的升高,染色强度也随之增强,在Ⅳ级胶质瘤中PLOD2呈强阳性,而在正常脑组织和Ⅱ级胶质瘤之间无统计学差异。此外,在上述结果基础上,汇总TCGA以及REMBRANDT Database中胶质母细胞瘤及非胶质母细胞瘤患者PLOD2mRNA表达数据,选用 ROC 曲线模型(Receiver Operating Characteristic Curve)分析PLOD2在疑诊胶质母细胞瘤中的诊断价值。ROC曲线计算曲线下面积为0.785(95%CI,0.785-0.828),提示PLOD2在胶质母细胞瘤鉴别诊断中具有较好的效度。2.PLOD2表达水平与胶质母细胞瘤患者的预后呈负相关借助TCGA数据库,剔除临床信息不全病例,分别纳入病例522例(OS)及386例(PFS),采用Kaplan-Meier法绘制PLOD2低表达和PLOD2高表达患者的生存曲线。结果发现,低表达组患者中位总生存期(OS)为14.95个月(95%CI,9.484-20.052个月),而高表达组的中位OS为13.93个月(95%CI,12.884-15.020个月);低表达组的中位无进展生存期(PFS)为10.22个月(95%CI,6.03-14.41个月),而高表达组的中位PFS为7个月(95%CI,6.141-7.859个月)。使用Log-rank test统计分析:低表达组和高表达组的OS和PFS之间差别均有统计学意义(OS,P0.05;PFS,P0.0005)。结论1.PLOD2在胶质瘤中高表达并与肿瘤级别呈正相关性;2.PLOD2表达程度与胶质母细胞瘤患者的预后呈负相关。第二部分乏氧调控胶质瘤赖氨酸羟化酶PLOD2的表达目的探究乏氧调控胶质瘤细胞赖氨酸羟化酶PLOD2的表达机制方法1.Western blot检测乏氧处理后胶质瘤细胞系U87和U251中PLOD2表达水平2.Western blot检测敲除内源性HiF-1α或HiF-2α或加入HiF-1α抑制剂后乏氧诱导胶质瘤细胞系U87和U251 PLOD2的表达情况3.PLOD2转录水平同HiF-1α转录水平的相关分析结果乏氧通过乏氧诱导因子-1α(HiF-1α)诱导PLOD2的表达在细胞U87与U251中,为了验证乏氧能否诱导PLOD2的表达,收集乏氧处理48 h的细胞,分别从mRNA和蛋白水平检测PLOD2表达程度,同时裂解乏氧不同持续时间(0,6 h,12h,24h,48h)处理后的细胞并进行Western blot检测。结果显示,乏氧可以诱导U87和U251中PLOD2的表达。同常氧组相比,乏氧处理后的肿瘤细胞PLOD2表达水平被显著性提高2～3倍且呈时间依赖性。采用siRNA敲除实验,进一步研究乏氧是通过HiF-lα还是HiF-2α来转录调控PLOD2的表达的。Western blot检测发现敲除U87与U251中内源性HiF-1α后可以抑制乏氧诱导的PLOD2的表达;但是敲除内源性HiF-2α并未抑制PLOD2的表达。为了进一步证实上述结果,将HiF-1α特异性抑制剂PX-478加入细胞培养基中,结果再次证实乏氧通过HiF-1α诱导PLOD2的表达。此外,TCGA数据库大数据相关分析结果同样支持上述结果:在胶质母细胞瘤患者中,PLOD2 mRNA转录水平同HiF-1a mRNA转录水平呈正相关(r2 = 0.215,P0,0001)。结论乏氧通过HiF-1α调控胶质瘤细胞中PLOD2的表达第三部分赖氨酸羟化酶PLOD2在乏氧诱导胶质瘤迁移与侵袭中的作用及机制目的明确赖氨酸羟化酶PLOD2在乏氧诱导胶质瘤迁移与侵袭中的作用及相关机制方法1.CCK8细胞增殖实验/平板克隆实验检测敲除PLOD2后胶质瘤细胞系U87和U251增殖能力变化2.ELISA检测乏氧处理后胶质瘤细胞系U87和U251上清中I型胶原纤维含量变化情况3.Transwell小室迁移模型检测敲除PLOD2后乏氧诱导胶质瘤细胞系U87和U251迁移能力变化4.3D侵袭模型检测敲除PLOD2后乏氧诱导胶质瘤细胞系U87和U251侵袭能力变化5.高分辨激光共聚焦显微镜观察敲除PLOD2后乏氧诱导胶质瘤细胞系U87和U251形态改变情况6.动物体内实验验证敲除PLOD2后胶质瘤细胞系U251颅内侵袭能力变化结果1.敲除PLOD2不影响胶质瘤细胞的增殖能力及胶原纤维合成为了研究PLOD2是否调控胶质瘤细胞的恶性进展,我们首先构建了特异性敲除PLOD2慢病毒载体shPLOD2及阴性对照慢病毒载体shNC。为了检验敲除PLOD2后胶质瘤细胞增殖能力及胶原合成能力的变化情况,我们选用上述慢病毒载体构建了稳定敲除PLOD2的胶质瘤细胞系U87和U251。CCK8细胞生长曲线显示,敲除PLOD2未改变肿瘤细胞的增殖能力,同时,细胞克隆形成能力也未受影响。对于PLOD2敲除后肿瘤细胞培养上清中I型胶原蛋白含量的变化情况,我们选用人源CollagenIELISA试剂盒检测。结果证实,乏氧本身可以诱导胶质瘤细胞I型胶原纤维的合成与分泌,但敲除PLOD2后未影响该过程。2.敲除PLOD2抑制胶质瘤细胞的迁移与侵袭分别将稳定敲除PLOD2(shPLOD2)和阴性对照(shNC)胶质瘤细胞U87和U251接种到迁移模型Transwell小室的上室,下室添加含20%FBS的完全培养基,然后将模型置于常氧或乏氧下12 h。结果显示,虽然乏氧促进U87和U251的迁移(～1.5倍,P0.001),但是敲除PLOD2后,肿瘤细胞迁移能力显著下降(30%,P0.001)。3D侵袭模型实验结果发现,在乏氧条件下,U87与U251细胞均增殖为结构良好的瘤球体,并且向周围基质最大程度的放射状侵袭,敲除PLOD2后,肿瘤细胞侵袭基质胶能力明显下降,尤其是在乏氧条件下。3.PLOD2通过FAK信号通路促进胶质瘤细胞的迁移与侵袭一方面,肿瘤细胞通过分泌基质金属蛋白酶MMPs协助自身侵袭,而我们Western blot的检测结果证实,在常氧和乏氧环境下肿瘤细胞U87和U251MMP-2和MMP-9的表达水平在敲除PLOD2前后未受影响。另一方面,肿瘤细胞迁移与侵袭过程中往往伴随细胞形态、骨架及黏着斑的变化。高分辨激光共聚焦显微镜观察发现乏氧可以显著性促进肿瘤细胞表面黏着斑的形成,表现为桩蛋白(Paxillin;绿色)与肌动蛋白纤维(Phalloidin;红色)在黏着斑上共定位的增加。在常氧和乏氧状态下,敲除PLOD2后黏着斑形成数目降低,肌动蛋白纤维排列杂乱。目前认为调控细胞形态及黏着斑形成的关键蛋白是黏着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)。结合形态学结果,我们推测FAK可能是PLOD2的下游靶分子。Western blot检测检测发现在常氧或乏氧环境下,敲除PLOD2可显著性降低肿瘤细胞U87和U251中FAK磷酸化水平(FAK-p397)。为进一步明确结果,我们使用FAK特异性抑制剂TAE226处理胶质瘤细胞,数据显示在乏氧诱导肿瘤细胞高表达PLOD2的同时,FAK抑制剂TAE226可以抑制FAK磷酸化水平(FAK-p397)。而且,在常氧及乏氧环境下,加入TAE226后肿瘤细胞的迁移与3D侵袭均受到抑制。4.动物实验:PLOD2可以促进胶质瘤细胞侵袭分别选用皮下成瘤及颅内原位种植肿瘤裸鼠模型加以验证,在皮下成瘤模型实验中,U251-shPLOD2组与U251-shNC组相比,肿瘤体积无明显差别。ELISA试剂盒检测瘤体内羟脯氨酸含量,间接反映瘤体内Ⅰ型胶原纤维含量,结果证实两组间无明显差别。瘤体硬度测定实验发现,与U251-shN组相比,U251-shPLOD2组瘤体硬度明显降低(P0.05)。在颅内原位种植胶质瘤模型中,U251-shNC组瘤体不规则,肿瘤细胞局部浸润明显,而U251-shPLOD2组瘤体呈现局限性,边界清晰。天狼星红染色发现,U251-shNC组瘤体内胶原纤维排布交错密集,分布于肿瘤细胞周围,而在U251-shPLOD2组中胶原纤维分布散在,较少形成交联。结论1.PLOD2通过FAK信号通路促进乏氧诱导胶质瘤细胞的迁移与侵袭;2.体内实验证实,胶质瘤细胞敲除PLOD2后可显著抑制其侵袭。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.41

【参考文献】