红景天苷对海人藻酸致痫小鼠的神经保护作用及其机制的探讨

发布时间：2018-04-04 14:01

本文选题：红景天苷　切入点：神经保护　出处：《河北医科大学》2016年博士论文

【摘要】：癫痫是一种常见的神经系统疾病,可以反复发作,有很高的发病率和致死率。在世界范围内,有1%的人口受到癫痫的困扰,我国也有近1000万癫痫患者,其中20%的患者会进展为难治性癫痫。癫痫长期反复发作可以引起认知功能障碍,严重影响患者的生活,给家庭和社会造成很大负担。目前,临床上应用抗癫痫药物(Antiepileptic drugs,AEDs)来控制癫痫发作,但是AEDs药物对三分之一的患者无效,甚至还会引起注意力下降、认知功能障碍等副作用。因此,急需寻找一种既能控制癫痫反复发作,又能改善患者认知功能障碍的药物。海人藻酸(Kainic acid,KA)是一种谷氨酸的同系物,可以激活谷氨酸受体,引起神经元损伤。高剂量的KA单次给药可以诱导实验动物的癫痫持续状态(Status epileptics,SE)发作,而SE会诱发自发性反复癫痫发作(Spontaneous recurrent seizures,SRS),这一过程类似于人类癫痫的发病过程,因此,该模型作为经典的癫痫在体动物模型被广泛应用于癫痫的研究。在海马神经元中,无Mg2+细胞外液可以诱导神经元稳定持久放电,而神经元反复异常的放电可以造成细胞结构改变,引起突触重构,最终形成异常的神经元网络,该细胞模型模拟了人类癫痫发作时神经元异常放电的过程,是比较成熟的癫痫离体模型。癫痫的发病机制至今尚未完全阐明,但一些重要的发病环节已为人类所知。目前,有几种学说受到研究者们的关注,包括离子通道、谷氨酸诱导的兴奋性神经毒、神经元网络、细胞凋亡和氧化应激等。氧化应激可以引起活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生过多,造成机体内源性的自由基和抗氧化酶失衡,引起细胞损伤。过多的ROS可以氧化DNA,调节细胞凋亡相关基因的异常表达,诱发神经元凋亡导致癫痫发作。因此,抗氧化剂在治疗癫痫方面有重要作用。红景天是生长于高海拔地区的植物,在我国主要分布于西藏。红景天苷(Salidroside,SDS)是从红景天的根茎中提取的主要活性成分。SDS有多种生物学活性,包括耐受缺氧、抗衰老、抑制肿瘤生长、消除炎症、缓解疲劳以及心血管保护效应。近些年发现,sds可以迅速通过血脑屏障(bloodbrainbarrier,bbb),对脑缺血、血管性痴呆、阿尔兹海默病(alzheimer’sdisease,ad)有治疗作用。此外,sds还可以改善低氧引起的大鼠学习记忆功能损伤,减轻脑缺血、ad、衰老诱发的认知功能障碍。然而,sds在癫痫中的作用尚未见相关报道。因此,本研究利用ka建立的小鼠se模型,从在体水平观察了sds对癫痫引起脑损伤的保护效应;利用无mg2+细胞外液诱导的癫痫细胞模型,从离体水平探讨了sds发挥保护作用可能的分子机制。本研究由以下三部分组成。第一部分红景天苷对海人藻酸诱导的小鼠癫痫持续状态的保护作用目的:建立ka诱导的小鼠se模型,观察sds预处理对癫痫发作、脑电图以及氧化应激损伤的作用。方法:将雄性8-10周的c57bl/6小鼠随机分为6组,对照组35只,其余各组56只。对照组(con):腹腔给予0.9%无菌生理盐水;ka组:ka溶于0.9%无菌生理盐水,腹腔给予30mg/kg的ka;sds25mg/kg+ka组:sds溶于0.9%无菌生理盐水,在注射ka前1h给予25mg/kgsds;sds50mg/kg+ka:在注射ka前1h给予50mg/kgsds;vehicle+ka组:在注射ka前1h给予0.9%无菌生理盐水;50mg/kgsds组:在0.9%无菌生理盐水注射前1h给予50mg/kgsds。在注射ka后2h,观察各组小鼠se潜伏期、se发生率以及脑电图改变,依据racine行为分级法,小鼠癫痫发作达到4级,持续时间至少30min认为是达到se。此外,在注射ka后15min、45min、3h、6h、12h、24h和48h分别取小鼠海马组织检测丙二醛(malondialdehyde,mda)含量、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)活性、还原型谷胱甘肽(reducedglutathione,gsh)含量。结果:1在注射ka后2h,有90%的小鼠存活,有80%的小鼠成功诱发se。与ka组小鼠相比,sds预处理可以延长se发作的潜伏期(p0.05),减少se的发病率(p0.05),增加小鼠的存活率,并且高浓度的sds(50mg/kg)比低浓度的sds(25mg/kg)有更明显的保护效应(p0.05)。con组和sds组小鼠均无癫痫发作,vehicle+ka组和ka组相比,小鼠se发作程度和潜伏期无统计学差异(p0.05)。2mda含量:与con组相比,小鼠海马组织mda含量在注射ka后15min开始增加,在45min达到峰值,之后随着时间推移,mda含量有所下降,但仍高于相同时间点的con组(p0.05);sds预处理可以明显减少ka组小鼠海马中mda含量(p0.05),并且sds50mg/kg组中mda含量低于sds25mg/kg组(p0.05);与ka组相比,vehicle+ka组小鼠海马组织中mda含量无明显改变(p0.05)。3sod活性:给予ka后15min,小鼠海马组织的sod活性开始下降,在45min时达到最低值(p0.05),之后有所增加,但仍低于相同时间点con组小鼠的sod活性(p0.05)。与ka组相比,sds预处理可以增加sod活性(p0.05),并且50mg/kg浓度的sds组使其增加更明显(p0.05);与ka组相比,vehicle+ka组小鼠海马组织中sod活性无明显变化(p0.05)。4gsh含量:不同实验组中小鼠海马组织gsh的改变趋势与sod相似,ka可以减少gsh含量,并且在45min时减少最明显(p0.05),而sds预处理可以增加gsh含量(p0.05),并且50mg/kg浓度的sds使其增加更明显(p0.05);vehicle+ka组小鼠海马组织中gsh的含量与ka组相比则无统计学差异(p0.05)。第二部分红景天苷对海人藻酸致痫小鼠认知功能障碍的保护作用目的:利用ka建立小鼠se模型,观察sds对srs发作、认知功能障碍和海马神经元损伤的保护作用。方法:本研究中共56只小鼠,其中10只小鼠作为对照组(con)每天腹腔注射0.9%无菌生理盐水,剩余46只小鼠腹腔给予30mg/kg的ka诱导se发作。依据racine行为分级法,小鼠癫痫发作达到4级,持续时间至少30min认为是达到se,成功诱导的se小鼠纳入后续实验。46只小鼠在注射ka后2h,41只存活,其中36只小鼠达到se发作,将其随机分为4组,每组9只。ka组:ka溶于0.9%无菌生理盐水,腹腔给予30mg/kg的ka;ka+sds5mg/kg组:sds溶于0.9%无菌生理盐水,在注射ka后第二天开始每天腹腔给予5mg/kgsds,连续给药14天;ka+sds10mg/kg组:从注射ka后第二天开始每天腹腔给予10mg/kgsds,连续给药14天;ka+vehicle组:从注射ka后第二天开始每天腹腔给予0.9%生理盐水,连续给药14天。同时,用v-eeg连续记录小鼠srs发作情况。14天后用morris水迷宫检测小鼠的空间学习记忆能力;用nissl染色观察海马ca1、ca3区存活神经元的形态和数目。结果:1con组小鼠无癫痫发作;46只小鼠注射ka后,存活率为89.13%,se发生率为78.26%。v-eeg结果显示,与ka组相比,ka+sds5mg/kg组和ka+sds10mg/kg组中srs每次发作持续时间明显缩短(p0.05),并且高浓度sds组中srs发作时间更短(p0.05)。ka+sds5mg/kg组和ka+sds10mg/kg组srs发作严重程度、发作频率均较ka组明显降低(p0.05)。ka+vehicle组和ka组相比,srs发作持续时间、严重程度和频率均无显著差异(p0.05)。2morris水迷宫:在定位航行实验中,随着训练时间增加,各组小鼠的逃逸潜伏期均缩短。从训练第二天开始,不同实验组小鼠的逃逸潜伏期出现差异:与con组相比,ka组小鼠逃逸潜伏期明显延长(p0.05);ka+sds5mg/kg组和ka+sds10mg/kg组小鼠逃逸潜伏期较ka组明显缩短(p0.05)。空间探索实验中,小鼠穿越平台次数有显著差异:与con组相比,ka组小鼠穿越平台的次数减少(p0.05);sds治疗组较ka组次数增多(p0.05),并且ka+sds10mg/kg组多于ka+sds5mg/kg组(p0.05)。ka组小鼠在目标象限逗留的时间比con组明显缩短(p0.05),ka+sds5mg/kg、ka+sds10mg/kg组小鼠在目标象限逗留的时间较ka组明显延长(p0.05)。ka+vehicle组与ka组相比,小鼠的逃逸潜伏期、穿越平台次数和在目标象限逗留的时间均无差异(p0.05)。可见平台实验中,不同实验组小鼠的游泳速度、逃逸潜伏期均无显著差别。3nissl染色:在con组中,小鼠海马ca1、ca3区神经元无明显丢失、结构完整、胞浆内nissl小体丰富;在ka组中,神经元出现明显丢失、细胞核固缩,nissl小体数量较con组减少;ka+sds5mg/kg和ka+sds10mg/kg组神经元结构相对完整,nissl小体数量较ka组增加。ka组小鼠海马ca1区和ca3区的神经元存活数量均较con组明显减少(p0.05);与ka组相比,ka+sds5mg/kg组和ka+sds10mg/kg组神经元数量显著增加(p0.05),并且ka+sds10mg/kg组ca1、ca3神经元数量均高于ka+sds5mg/kg组(p0.05);ka+vehicle组海马神经元存活数量与ka组相比无统计学差异(p0.05)。第三部分红景天苷在癫痫细胞模型中的保护作用及其分子机制目的:应用无mg2+细胞外液孵育小鼠海马神经元建立细胞癫痫模型,观察sds对癫痫细胞损伤的影响及其可能的作用机制方法:利用出生24h内的小鼠分离出海马神经元,接种到培养基中,培养到第7天,将细胞随机分为8组:正常对照组(con):含有1mmol/lmg2+的细胞外液,作用神经元3h后,更换为正常培养基;细胞模型组(model):不含mg2+的细胞外液,作用3h后,更换为正常培养基;sds30μmol/l组:不含mg2+的细胞外液,作用3h后,加入含有sds浓度为30μmol/l的培养基作用2h,更换为正常培养基;sds60μmol/l组:不含mg2+的细胞外液,作用3h后,加入60μmol/lsds作用2h后,更换为正常培养基;sds120μmol/l组:不含mg2+的细胞外液孵育3h后,加入120μmol/lsds作用2h,更换为正常培养基;compoundc组:不含mg2+的细胞外液孵育3h后,加入120μmol/lsds作用2h,再加入50μmol/lcompoundc作用1h,更换为正常培养基;sirtinol组:不含mg2+的细胞外液孵育3h后,加入120μmol/lsds作用2h,再加入100μmol/lsirinol作用1h,更换为正常培养基;vehicle组:不含mg2+的细胞外液孵育3h后,加入和120μmol/lsds相同体积的0.9%无菌生理盐水作用2h,更换为正常培养基。在各种药物作用结束后24h,采用cck-8检测细胞活力,ldh检测细胞损伤程度,calcein-am/pi进行活细胞计数,流式细胞仪检测细胞凋亡率,real-timepcr检测ampk、sirt1的mrna水平,westernblot检测ampk、sirt1的蛋白表达,sirt1去乙酰化酶活性分析检测sirt1去乙酰化酶活性。结果:1cck-8检测:与con组相比,癫痫细胞活力明显下降(p0.05);建立癫痫细胞模型后,给予30μmol/l、60μmol/l、120μmol/l三个剂量的sds,60μmol/lsds组和120μmol/lsds组细胞活力较癫痫细胞组增加,并且120μmol/lsds组增加更明显(p0.05);vehicle组和癫痫细胞组相比细胞活力无明显改变(p0.05)。2ldh检测:癫痫细胞ldh释放量较con组明显增加(p0.05),sds可以抑制ldh的释放,并且呈现剂量依赖性,120μmol/l浓度的sds对ldh的释放有更明显的抑制作用(p0.05);与癫痫细胞组相比,vehicle组细胞ldh活性无统计学差异(p0.05)。3calcein-am/pi双染:癫痫模型组细胞存活率较con组明显减少(p0.05);与癫痫模型组相比,sds使细胞存活率显著增加(p0.05);vehicle组和模型组相比,细胞存活率无明显差异(p0.05)。4细胞凋亡检测:与con组相比,癫痫细胞组细胞凋亡率明显增加(P0.05),SDS可以减少癫痫组细胞的凋亡率(P0.05);Compound C是AMPK(AMP-activated protein kinase,AMPK)抑制剂,Sirtinol为SIRT1(Silent information regulator 1,SIRT1)酶活性抑制剂,Compound C和Sirtinol可以抑制SDS对癫痫细胞凋亡的影响;Vehicle组和模型组相比,细胞凋亡率无统计学差异(P0.05)。5Real-Time PCR:与Con组相比,癫痫组细胞中AMPK的mRNA水平下调(P0.05);SDS组与癫痫细胞组相比,AMPK的mRNA水平上调(P0.05);Vehicle组和模型组AMPK的mRNA水平无差异。SIRT1的mRNA水平在各组间无明显改变。6 Western blot:与Con组相比,癫痫模型组细胞AMPK的蛋白表达明显减少(P0.05);SDS可以使模型组AMPK的表达增加(P0.05);Vehicle和模型组相比,AMPK的蛋白表达无明显差异(P0.05)。SIRT1的蛋白表达在各组间无明显改变。7 SIRT1去乙酰化酶活性:癫痫细胞组SIRT1去乙酰化酶活性较Con组降低(P0.05);与模型组相比,SDS组SIRT1活性增加(P0.05);Compound C组SIRT1酶活性较SDS组明显降低(P0.05);Vehicle组与模型组相比,SIRT1酶活性无明显差异(P0.05)。结论:1在KA诱导的小鼠SE模型中,SDS预处理可能通过改善氧化应激损伤而起到抑制SE发作的作用,并且在注射KA后45 min有最显著作用。2在KA诱导的小鼠SE模型中,SRS引起小鼠认知功能障碍和海马CA1、CA3区神经元损伤;SDS后处理可以抑制SRS发作,并且可能通过减轻神经元损伤而改善小鼠的认知功能。3在应用无Mg2+细胞外液孵育小鼠海马神经元建立的细胞癫痫模型中,SDS可能通过激活AMPK/SIRT1信号通路抑制细胞凋亡,从而减轻癫痫引起的神经元损伤。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.1

【参考文献】