酿酒酵母中synphilin-1蛋白聚集物形成分子机理的研究

发布时间：2018-04-08 21:27

本文选题：synphilin-1　切入点：酿酒酵母　出处：《哈尔滨工业大学》2016年博士论文

【摘要】：帕金森氏症是一种常见的神经退行性疾病,该疾病的典型特征之一是神经细胞中蛋白内含体的形成。Synphilin-1蛋白是帕金森氏症蛋白内含体的主要组分之一,与其他帕金森氏症病理相关蛋白之间存在相互作用,暗示着synphilin-1蛋白的聚集在帕金森氏内含体的形成中起重要作用。然而,由于在人体以及哺乳动物体内研究该蛋白聚集物形成过程的限制性以及基因组的复杂性,synphilin-1蛋白聚集物形成的分子机理尚不明确。细胞内蛋白聚集的过程和生物学途径在真核生物中是高度保守的,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中存在大量人类同源基因,且该模型存在诸多优势,因此,本课题利用酿酒酵母模型,以synphilin-1蛋白聚集物作为研究对象,采用基因组水平的酵母高通量图像筛选方法,结合合成遗传阵列(Synthetic genetic array)技术,筛选得到对synphilin-1蛋白聚集物形成产生影响的基因。再通过生物信息学方法,构建与其相互作用基因的网络谱图,考察这些基因所涉及的功能复合体或生物学途径,探索酿酒酵母细胞中synphilin-1蛋白聚集物形成的分子机理。为了从基因组水平探索影响synphilin-1蛋白聚集物形成的基因,本课题首先通过酵母转化法,获得异源表达synphilin-1蛋白的质询菌株(Query strain)Y7092-285。以该质询菌株为基础,运用合成遗传阵列技术构建得到表达融合有红色荧光标签的synphilin-1蛋白的酿酒酵母单基因突变菌株库,命名为S2YDSY1。通过对S2YDSY1库中菌株的生长情况进行测定,并进行比较筛选,得到57株呈现显著生长缺陷状态的突变菌株。对筛选得到的57个抑制synphilin-1诱导细胞毒性的基因进行功能富集(Functional enrichment)分析,发现这些基因所在功能组主要涉及细胞骨架运输途径、膜质生物合成,THO复合体以及Prefoldin蛋白复合体。然后,结合基因组水平的酵母高通量图像技术,开发并验证了一种针对荧光蛋白标记的synphilin-1蛋白聚集物的高通量筛选方法,筛选得到133个促进synphilin-1蛋白聚集物形成的基因。对影响synphilin-1蛋白聚集物的基因和功能组进行探讨,表明了细胞骨架组织、组蛋白修饰,姊妹染色单体分离、糖脂生物合成途径和DNA复制途径参与了synphilin-1蛋白聚集物的形成。为了进一步明确筛选得到基因与synphilin-1蛋白聚集物形成的联系,对synphilin-1蛋白聚集物形成筛选和生长合成缺陷(Synthetic sick)筛选重叠基因进行分析,发现DYN3,GIM4,KAR3,NUM1,PAC10,SHE4,YKE2,VAC14,ACT1,GPI19基因在酿酒酵母中促进了synphilin-1蛋白聚集物的形成,并抑制了synphilin-1蛋白诱导的细胞毒性;结论支持了“成熟聚集物的形成是一系列事件的末期,可能对细胞机体具有一定的保护效应”的假设。且GIM4,KAR3,PAC10,SHE4,YKE2,VAC14,ACT1基因都存在人类同源基因,这也为后续在人模型中进一步研究synphilin-1聚集物的形成以及帕金森氏症病理提供一个突破点。利用细胞染色和免疫荧光等方法,发现细胞内synphilin-1蛋白聚集物与线粒体结构和肌动蛋白骨架共定位,且synphilin-1聚集物形成后即积累于胞内近核质量控制区域,也存在于液泡附近的外周质量控制区域内,因此认为在酵母细胞中synphilin-1蛋白聚集物的形成是一种附着于线粒体,以肌动蛋白为主的固定和转运过程,且组蛋白的修饰和糖脂生物合成途径对该聚集起促进作用。在酿酒酵母模型中对synphilin-1蛋白聚集物形成分子机理的研究,阐明了影响该蛋白聚集物形成的基因和功能组,为后续在人类细胞或者动物模型中研究synphilin-1蛋白聚集物形成以及毒性奠定了基础,并为进一步理解帕金森氏症的病理提供理论依据。
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【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R742.5

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