颞叶癫痫海马区星形胶质细胞大麻素Ⅰ型受体的表达及功能研究

发布时间：2018-04-10 00:19

  本文选题：大麻素Ⅰ型受体　切入点：星形胶质细胞　出处：《第四军医大学》2014年博士论文

【摘要】：背景 大麻素Ⅰ型受体（cannabinoid type1receptor, CB1R）是一类广泛表达于中枢神经系统突触前膜的G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor, GPCR），感受突触后逆向分泌的内源性大麻素(endogenous cannabinoid, EC)，抑制神经递质释放，从而调控突触传递乃至神经元兴奋性，在癫痫发生机制中发挥重要作用。但是目前关于CB1R在癫痫中的作用尚无统一的结论。有研究报道CB1R激动剂可以抑制癫痫发作，但也有文献报道CB1R激动剂可以促进癫痫发作。这些矛盾的研究结果提示，很可能存在突触以外尚未被发现的CB1R表达，具有和突触上CB1R不同的调控机制。最新报道提示，星形胶质细胞（astrocyte,AST）上存在CB1R，并且在维持大鼠海马癫痫样放电中发挥重要作用。但星形胶质细胞上的CB1R是否参与了慢性癫痫发生，特别是药物难治性癫痫的发生机制，尚无明确结论。因此，我们对星形胶质细胞上CB1R在颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy, TLE），一种常见的药物难治性癫痫，的发 生过程中的作用机制进行探讨。目的 观察颞叶癫痫患者硬化海马星形胶质细胞CB1R的表达特点，进而明确颞叶癫痫发生过程中星形胶质细胞CB1R时空表达特征及超微结构，最后探讨CB1R是否参与活化状态星形胶质细胞的促兴奋机制。 方法 首先收集15例颞叶癫痫患者及5例急性脑外伤患者手术切除的海马组织分别作为癫痫组和对照组，应用免疫荧光双标和激光共聚焦显微镜技术，观察硬化海马星形胶质细胞上CB1R的表达特征；依据TLE硬化海马组织中星形胶质细胞的CB1R表达高低将患者分为阳性表达组和阴性表达组，对两组患者的年龄、发病年龄、病程、平均发作持续时间、平均发作频率等临床指标进行比较，将具有显著性差异的指标和星形胶质细胞CB1R的表达进行相关性分析；然后制作锂匹罗卡品大鼠癫痫模型，模拟TLE发生过程和海马硬化，分别在癫痫持续状态（status epilepticus, SE）后3天和4周应用免疫荧光双标和激光共聚焦显微镜检测海马星形胶质细胞上CB1R表达；在SE后4周通过免疫电镜对硬化海马星形胶质细胞上的CB1R进行超微结构观察；最后体外进行星形胶质细胞原代培养，用促炎物质脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）对其进行干预，模拟TLE海马硬化时星形胶质细胞的变化；使用TUNNEL法检测细胞凋亡，MTT法检测细胞存活率；利用免疫细胞化学和激光共聚焦技术检测LPS干预后星形胶质细胞的CB1R分布变化，并利用Western Blot检测LPS干预后星形胶质细胞上CB1R的表达改变；对LPS处理后的星形胶质细胞和未处理的星形胶质细胞同时给与CB1R激动剂WIN552122干预，应用高效液相色谱质谱/质谱联用法（HPLC MS/MS）检测两组细胞外液中的谷氨酸浓度，同时使用激光共聚焦显微镜钙成像技术检测星形胶质细胞胞内钙离子浓度的变化。 结果 （1）在对临床标本的研究中，对照组所有患者海马组织星形胶质细胞上没有检测到CB1R表达，而在TLE患者硬化海马组织的星形胶质细胞上有9例检测到CB1R表达，6例没有检测到CB1R表达； （2）星形胶质细胞上CB1R表达阳性和阴性的两组TLE患者的平均每月发作次数存在显著性差异，且相关性分析显示硬化海马表达CB1R的星形胶质细胞的阳性率和癫痫发作频率存在正相关； （3）在动物在体实验中，生理盐水对照组大鼠海马星形胶质细胞上没有检测到CB1R表达，而癫痫组大鼠在SE后3天CB1R就已经开始表达于部分海马星形胶质细胞，SE后4周时大鼠海马表现出神经元丢失和星形胶质细胞增生，且几乎所有星形胶质细胞呈CB1R阳性表达； （4）SE后4周的超微结构研究发现，生理盐水对照组星形胶质细胞极少出现CB1R表达，但是在硬化海马增生肥大的星形胶质细胞上CB1R表达明显，并且部分CB1R表达于增生肥大星形胶质细胞的细胞膜上； （5）在离体细胞实验中，LPS干预导致星形胶质细胞激活，，同时其CB1R表达增多，并且分布从细胞核周围向远离细胞核方向移动； （6）CB1R激动剂WIN552122引起LPS干预星形胶质细胞的胞内Ca2+荧光值增加幅度明显高于正常对照增加的幅度，同时，WIN552122引起LPS干预细胞外液中谷氨酸浓度明显增加，且明显高于正常对照增加的幅度。 结论 部分TLE患者硬化海马星形胶质细胞存在CB1R表达，且CB1R阳性星形胶质细胞的百分率与发作频率存在直接联系，提示星形胶质细胞上CB1R可能与癫痫形成存在联系；通过动物模型模拟颞叶癫痫发生过程，星形胶质细胞上CB1R表达明显升高且存在上膜改变，提示星形胶质细胞上CB1R可能参与了癫痫发生的机制；进一步的离体细胞实验发现活化状态的星形胶质细胞上CB1R功能提高，升高细胞内钙离子浓度，释放谷氨酸的能力明显增强，提示CB1R可能是通过增强星形胶质细胞的促兴奋作用而参与癫痫发生的机制。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R742.1

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本文编号：1728825