靶向干扰Diaph1表达对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移的影响及分子机制的研究

发布时间：2018-04-13 20:31

  本文选题：脑胶质瘤 + Diaph1　； 参考：《上海大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景与目的:脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发性颅内恶性肿瘤,由胶质细胞癌变产生。脑胶质瘤具有高侵袭性和高致死率,肿瘤细胞呈浸润性生长,与周围正常脑组织边界不清,手术切除无法根治。因此,在分子水平上寻找治疗脑胶质瘤的有效靶基因是目前神经科学领域研究的热点之一。哺乳动物透明基因相关成蛋白1(Diaph1)是一种肌动蛋白成核因子,与早期发现的黑腹果蝇Diaphanous蛋白、鼠的肢体畸形蛋白等结构相似,有两个保守的成蛋白同源结构域。Diaph1参与了多种以肌动蛋白为基础的生物学过程,如伪足与细胞极性的形成、细胞黏附和运动等,并在病理情况下有过表达。本研究旨在探讨Diaph1在脑胶质瘤细胞侵袭与迁移过程中的作用及机制,增加我们对Diaph1作为脑胶质瘤重要节点分子的信号调控网络的了解,为Diaph1研究成果向临床应用转化提供重要的理论依据。研究方法:1.通过组织免疫化学染色的方法检测Diaph1蛋白在人恶性脑胶质瘤组织和人正常脑组织中的表达情况;采用免疫荧光染色的方法检测Diaph1蛋白在脑胶质瘤细胞系U87和U251中的表达情况。2.构建Diaph1 RNA干扰质粒,下调U87和U251中Diaph1的表达,并用荧光实时定量PCR、Western blot检测干扰效率。3.下调U87和U251中Diaph1表达后,分别采用细胞增殖实验、细胞凋亡实验和细胞划线实验检测细胞的增殖能力,诱导细胞发生凋亡的能力及细胞侵袭与迁移能力的变化情况。4.下调U87和U251中的Diaph1表达后,分别采用荧光实时定量PCR、Western blot和明胶酶谱方法检测下胞内MMP2和MMP9的m RNA和蛋白质表达水平及胞外活性MMP2和MMP9量的变化情况。5.构建CRISPR/Cas9/g RNA-Diaph1敲除质粒对U87和U251中Diaph1基因进行敲除,并用Western blot检测敲除效果。6.采用Western blot方法检测敲除U87和U251中Diaph1基因表达对细胞中E-Cadherin、α-Catenin和α-Tubulin蛋白表达水平的影响。7.采用免疫荧光染色的方法检测U87和U251中,内源性Diaph1与E-Cadherin、α-Catenin和α-Tubulin之间是否存在分布上的共定位。8.采用免疫共沉淀的方法检测脑胶质瘤细胞系U87和U251中,内源性Diaph1与E-Cadherin、α-Catenin和α-Tubulin之间是否存在相互作用。9.使用String数据库构建以Diaph1为中心的人类细胞PPI网络图,并对图中的基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。结果:1.Diaph1蛋白在人恶性脑胶质瘤组织和人正常脑组织中均有表达,表达量与肿瘤恶性程度呈正相关;Diaph1蛋白在U87和U251中均有分布,且主要分布在细胞质中。2.成功构建Diaph1 RNA干扰质粒,该质粒能够有效下调U87和U251中的Diaph1m RNA和蛋白表达。3.转染Diaph1 RNA干扰质粒的U87和U251细胞增殖能力受到抑制,凋亡能力增强,侵袭与迁移能力减弱。4.转染Diaph1 RNA干扰质粒可降低U87和U251细胞表达MMP2和MMP9m RNA和蛋白质的水平并减少细胞向胞外分泌活性MMP2和MMP9的量。5.成功构建CRISPR/Cas9/g RNA-Diaph1敲除质粒,转染该质粒后U87和U251中Diaph1蛋白几乎不表达。6.转染CRISPR/Cas9/g RNA-Diaph1敲除质粒的U87和U251中E-Cadherin和α-Catenin蛋白表达水平有一定升高,α-Tubulin表达水平无变化。7.U87和U251中,内源性Diaph1与E-Cadherin、α-Catenin和α-Tubulin存在分布上的共定位。8.U87和U251中,内源性Diaph1与E-Cadherin、α-Catenin和α-Tubulin之间存在一定程度的相互作用关系。9.成功构建以Diaph1为中心的人类细胞的PPI网络图,对网络中的60个基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析,并预测泛素C与Src蛋白可能是参与Diaph1功能的关键蛋白。结论:本研究探讨了下调Diaph1的表达对脑胶质瘤细胞系U87和U251增值能力、凋亡能力,侵袭与迁移能力的重要影响,并进一步揭示了Diaph1在脑胶质瘤中可能的作用机制,对Diaph1的深入研究方向进行预测,为该基因应用于临床上脑胶质瘤治疗提供了理论依据。
[Abstract]:The expression of Diaph1 protein in human malignant glioma cell line U87 and U251 was investigated by means of immunofluorescence staining . In U87 and U251 , endogenous Diaph1 and E - cadherin , 伪 - Cavities and 伪 - Tubulin in U87 and U251 were successfully constructed .

【学位授予单位】：上海大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

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