PINK1介导Bnip3磷酸化及其对线粒体自噬的调节机制研究

发布时间：2018-04-19 21:41

  本文选题：帕金森病 + PINK1　； 参考：《中南大学》2014年硕士论文

【摘要】：帕金森病(Parkinson's Disease, PD)是一种最常见的神经退行性运动障碍疾病,其发生率在神经系统疾病中排名第二,仅次于老年痴呆症,在我国65岁以上人群中的发病率约为1.7%[1]。PD病理表现为中脑黑色致密部多巴胺能神经元的选择性丢失以及神经元中异常蛋白聚集或路易小体的形成。通过对PD病人的致病突变分析,目前鉴定了16个PD致病基因[2,3]。其中多个基因被报道与线粒体的功能调节相关,这提示线粒体与PD发病存在相关性。PINK1突变会导致常染色体隐性遗传的pD[4]。该基因编码的蛋白质是一种线粒体膜定位的磷酸激酶,对维持线粒体的稳态和功能具有重要作用。然而目前对PINK1磷酸化底物的研究报道并不多。前期的质谱结果提示,Bnip3可能是PINK1的磷酸化底物,磷酸化位点为Bnip3S95区域。Bnip3是Bcl-2家族中BH3-only亚家族成员蛋白,主要定位于线粒体外膜,当细胞处于缺氧环境时表达上调。Bnip3的高表达可以引起线粒体自噬[5],而干扰Bnip3会抑制线粒体自噬从而降低细胞的抗逆性[6]。而研究PINK1与Bnip3的线粒体功能调控关系,能有助于我们发现新的PINK1激酶调控通路。 目的：研究PINK1介导Bnip3磷酸化及其对线粒体自噬的调节机制。 方法：1.通过免疫共沉淀实验,我们检测PINK1与Bnip3是否存在相互作用,同时PINK1的激酶失活突变G309D与D384N是否影响两者的相互作用。2.外源表达PINK1野生型和激酶失活突变体并用CCCP处理,检测内源性Bnip3蛋白水平。及检测PINK1激酶活性的增加及CCCP处理后是否影响了内源性Bnip3的蛋白水平。3.为研究PINK1磷酸化Bnip3的对Bnip3的功能调控作用,我们构建并表达Bnip3模拟磷酸化和模拟去磷酸化突变体Bnip3S94D和Bnip3S95A,以及扩大化磷酸突变区域的Bnip3S92/93/95A和Bnip3S92/93/95D突变体,通过免疫共沉淀以及免疫荧光实验,检测Bnip3的95位丝氨酸区域对线粒体自噬的影响。 结果：PINK1与Bnip3存在蛋白互作,Bnip3S95区域的磷酸化状态没有改变自身介导的自噬水平。 结论:PINK1能与Bnip3产生相互作用,提示可能由此介导Bnip3S95位点的磷酸化,但S95位点的磷酸化不影响Bnip3介导的线粒体自噬。
[Abstract]:Parkinson's disease (Parkinson's Disease, PD) is the most common neurodegenerative dyskinesia. Its incidence is ranked second in the disease of nervous system, second only to Alzheimer's disease. The incidence of 1.7%[1].PD in the population over 65 years old is about the selective loss of dopaminergic neurons in the black dense medium of the middle brain. And the formation of abnormal proteins in the neurons or the formation of Louis corpuscle in the neuron. Through the analysis of the pathogenic mutation of PD patients, 16 PD gene [2,3]. genes are identified, and many of them are reported to be related to the mitochondrial function regulation, which suggests that the correlation of the mitochondrial and PD is associated with the.PINK1 mutation that leads to the autosomal recessive pD[4].. The protein encoded by the gene is a mitochondrial membrane localization phosphokinase, which plays an important role in maintaining the homeostasis and function of mitochondria. However, there are few reports on the PINK1 phosphorylation substrate at present. The previous mass spectrometry results suggest that Bnip3 may be the substrate for phosphorylation of PINK1, and the phosphorylation site is Bnip3S95 region.Bnip3 is Bcl-2 The protein of the BH3-only subfamily in the family is mainly located in the mitochondrial membrane. When the cells are in a hypoxic environment, the expression of up regulation of.Bnip3 can cause mitochondrial autophagy [5], while interfering Bnip3 can inhibit mitochondrial autophagy and decrease the resistance [6]. of cells, it can help to study the mitochondrial function regulation of PINK1 and Bnip3. We found a new PINK1 kinase regulation pathway.
Objective: To study the mechanism of PINK1 mediated Bnip3 phosphorylation and its regulation on mitochondrial autophagy.
Methods: 1. through the immunoprecipitation experiment, we detected the interaction between PINK1 and Bnip3, and whether the PINK1 kinase inactivation mutation G309D and D384N affect the interaction between.2. and.2. to express the PINK1 wild type and kinase inactivation mutants and use CCCP to detect the endogenous Bnip3 protein level and detect the activity of PINK1 kinase. Whether the increase and CCCP treatment affects the protein level.3. of endogenous Bnip3 is the functional regulation of PINK1 phosphorylated Bnip3 to Bnip3. We construct and express Bnip3 mimic phosphorylation and analog dephosphorylation mutants Bnip3S94D and Bnip3S95A, and Bnip3S92/93/95A and Bnip3S92/93/95D mutations in the enlarging phosphoric acid mutation region. The effects of 95 serine region of Bnip3 on mitochondrial autophagy were examined by immunoprecipitation and immunofluorescence assay.
Results: there was protein interaction between PINK1 and Bnip3. The phosphorylation status of Bnip3S95 did not alter the level of autophagy mediated by autophagy.
Conclusion: PINK1 can interact with Bnip3, suggesting that the phosphorylation of the Bnip3S95 site may be mediated, but the phosphorylation of the S95 site does not affect the mitochondrial autophagy mediated by Bnip3.

【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R742.5

【共引文献】

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本文编号：1774832