丁苯酞对实验性脑梗死小鼠神经功能改善和神经再生的影响及其作用机制的研究
本文选题:缺血性脑卒中 + 神经再生 ; 参考:《河北医科大学》2017年博士论文
【摘要】:缺血性脑卒中是由于流向大脑区域的血流中断,导致氧气和葡萄糖供应缺乏而引起的,是全球死亡和成人致残的主要原因。更重要的是,随着人口老龄化的到来,人们预期寿命的增加,中风的发病率和患病率预计将进一步上升,已成为世界上最重要的健康问题之一。尽管静脉内溶栓目前批准用于治疗急性缺血性中风,但由于其狭窄的治疗时间窗和安全问题,其临床应用仍然受到限制。因此,大多数中风患者将有残留的神经功能缺陷。所以,这就强调需要开发神经恢复剂,从而减少脑损伤程度或恢复卒中后脑功能。尽管中枢神经系统修复能力有限,但是脑缺血后会有一定程度的自发性修复,这种修复过程涉及血管新生、神经再生、轴突出芽和突触发生。自从报道称大脑有能力在一个称为神经再生微环境的区域形成新的神经元,神经再生就开始成为一个广受关注的话题。包括人在内的各种哺乳动物中,成年脑中侧脑室的室管膜下区(subventricular zone,SVZ)和海马齿状回的颗粒下区(subgranular zone,SGZ)是神经再生的两个主要部位,含有神经干细胞(neural stem cells,NSCs),具有增殖、迁移并分化为成熟神经元的能力。缺血性卒中后,血管新生是形成新的脑微血管的重要过程,可改善缺血半暗带区的组织微灌注,并且血管新生被证实影响脑缺血后神经再生和成神经细胞迁移的过程。同时,脑缺血诱导SVZ区神经再生,新生成的神经元向有新生血管的皮层缺血半暗带迁移,并且在神经迁移过程中,成神经细胞与脑血管密切相关。最近的实验证据证明,中风后神经功能改善可能是通过内源性神经干细胞来源的神经元替代诱导的。因此,旨在激活脑缺血后自我修复系统以替代死亡的神经元,这将是一个很有前景的研究领域。经典Wnt/β-Catenin信号通路在哺乳动物中枢神经系统发育过程中发挥重要作用,并继续调节整个成年时期的多种过程,包括干细胞池的维持和自我更新、祖细胞增殖和成年神经发生。最近许多关注集中在Wnt/β-Catenin信号对海马神经发生的关键作用,而越来越多的研究也证实其在SVZ区神经祖细胞增殖以及神经发生过程中起重要作用。大量证据证明Wnt/β-Catenin信号通路调节中风后SVZ区神经发生过程,从而参与中风后的神经修复。因此,靶向激活Wnt/β-Catenin信号传导活性从而促进神经发生可能是促进组织修复和功能恢复的再生治疗策略的一种新方法。L-3-正丁基苯酞最早提取于芹菜种子中,dl-3-正丁基苯酞(dl-3-nbutylphthalide,dl-NBP)是基于此化学合成的含有L-和D-异构体的手性化合物,并于2005年被国家食品药品监督管理总局(SFDA)批准作为临床治疗缺血性卒中的新型药物。临床试验表明:NBP可以显著改善缺血性脑卒中患者的行为结果和认知功能,具有良好的安全性和耐受性。许多基础研究也已证实,NBP可通过多重药理机制用于治疗缺血性中风,是一种有益和有前景的药物,包括抑制血小板聚集和抗血栓形成,保护线粒体功能,调节能量代谢,减少神经元凋亡,减少氧化损伤,下调自噬活性,抑制炎症和保护血脑屏障。此外,NBP可以促进啮齿动物卒中后的血管新生和改善脑微循环。然而,以前的研究中关于NBP对缺血性中风后神经再生的研究却很少。本研究采用健康成年雄性C57BL/6小鼠为研究对象,建立电凝法远端大脑中动脉闭塞(distal middle cerebral artery occlusion,d MCAO)模型。在本研究中,我们主要研究dl-NBP是否改善脑缺血后神经恢复和促进SVZ区内源性神经再生,以及Wnt/β-Catenin通路和神经营养因子的作用是否参与其中。本研究分为三部分,各部分内容概述如下。第一部分丁苯酞对实验性脑梗死小鼠神经功能改善、脑保护及促进血管新生的作用目的:通过对dl-NBP干预后实验性脑梗死小鼠的神经功能缺损、脑梗死体积、脑萎缩体积、脑血流改变以及血管密度的测定,研究dl-NBP对脑缺血小鼠的神经保护及血管新生作用。方法:采用健康成年雄性C57BL/6小鼠为研究对象,通过电凝法建立d MCAO模型。实验一:将C57BL/6小鼠随机分为以下各组:假手术组(Sham):动物接受假手术和等体积的0.5%吐温-80;Vehicle组(Vehicle):动物接受d MCAO和等体积的0.5%吐温-80;NBP低剂量组(NBP-L):动物接受d MCAO,并给予10 mg/kg NBP;NBP中剂量组(NBP-M):动物接受d MCAO,并给予20 mg/kg NBP;NBP高剂量组(NBP-H):动物接受d MCAO,并给予40 mg/kg NBP。术后1天开始给予NBP腹腔注射直至取材或连续13天,分别于术前、术后3、7、14、21、28天对各组小鼠进行Rota-Rod、m NSS神经功能评分,同时测量体重变化。实验二:将C57BL/6小鼠随机分为以下各组:Vehicle组(Vehicle)和NBP中剂量组(NBP),于术后7天用TTC染色法测定脑梗死体积,28天用HE染色测定脑萎缩体积,于术前、术后即刻、7、14、28天使用激光散斑成像仪监测脑血流量(CBF)。实验三:将C57BL/6小鼠随机分为以下各组:假手术组(Sham)、Sham+NBP组(Sham+NBP)、Vehicle组(Vehicle)和NBP中剂量组(NBP),于术后14天用CD-31染色分析缺血半暗带的微血管密度。结果:1 Rota-Rod实验结果显示:在第7天,与Vehicle组相比,三种剂量的NBP均明显改善了神经功能恢复(P0.01)。然而,随后在第14、21和28天仅NBP-M组显示出明显差异(P0.01)。m NSS结果显示:在术后第3、7天,Vehicle组和NBP组之间没有显著差异。但是中风后14、21、28天,NBP-M组小鼠的神经缺陷评分明显低于Vehicle组(*P0.05,**P0.01)。但是,NBP-L和NBP-H组在任何时间点都没有显示出明显差异。体重变化结果显示:接受手术后不同组中的小鼠的体重在前3天快速降低,然后在第14或21天缓慢恢复至基线水平。然而,五组之间的差异无统计学意义(P0.05)。鉴于NBP-M组明显改善神经功能缺损症状,我们选择20 mg/kg NBP进行后续实验。2 TTC染色结果显示:在d MCAO后第7天,NBP组小鼠的脑梗塞体积显著小于Vehicle组(P0.05)。HE染色结果显示:在d MCAO后第28天,Vehicle组和NBP组脑萎缩体积无明显差异(P0.05)。3 CBF测量结果显示:小鼠d MCAO后对侧的脑灌注量轻微降低(约下降到83%),但在同侧CBF立即明显降低至约38%基线水平(P0.001)。右侧MCA供血区域中,CBF随着时间的推移逐渐恢复,在第14天达最大恢复水平。并且,在第14天,与Vehicle组小鼠相比,NBP小鼠显示出更高的CBF(P0.05)。在中风后即刻、7天和28天,Vehicle组和NBP组小鼠脑灌注量未观察到明显差异。CD31免疫荧光染色显示:在d MCAO后第14天,与Vehicle组相比,NBP组小鼠缺血半暗带区的微血管密度显著增多(P0.01)。第二部分丁苯酞对实验性脑梗死小鼠神经干细胞增殖的影响及其相关机制研究目的:通过测定神经干细胞标记物及Wnt/β-Catenin通路相关因子表达水平,观察dl-NBP对实验性脑梗死小鼠神经干细胞增殖以及Wnt/β-Catenin的影响。方法:采用健康成年雄性C57BL/6小鼠为研究对象,通过电凝法建立d MCAO模型。实验一:将C57BL/6小鼠随机分为以下各组:假手术组(Sham),Sham+NBP组(Sham+NBP),Vehicle组(Vehicle)和NBP组(NBP)。于术后7天、14天使用Brd U+和Brd U+/Nestin+标记评估NBP对神经增殖的影响,于术后7天通过qRT-PCR和Western Blot测量Wnt通路在NBP治疗中的作用。实验二:将C57BL/6小鼠随机分为以下各组:Vehicle组(Vehicle)、NBP组(NBP)、DKK1组(DKK1)和DKK1+NBP组(DKK1+NBP)。重组人类DKK1蛋白(rh DKK1)用于阻止经典Wnt信号通路。将DKK1以0.1μg/μl的浓度溶于无菌PBS中,并在术后第1天和第4天将1μl溶液通过脑室注射到同侧侧脑室。于术后7天使用Brd U+和Brd U+/Nestin+标记评估NBP对神经增殖的影响,于术后7天通过qRT-PCR和Western Blot测量Wnt通路在NBP治疗中的作用。结果:1与Sham组小鼠相比,脑缺血后7天和14天,同侧SVZ中Brd U和Brd U/Nestin-阳性细胞数明显增加。与Vehicle组相比,20 mg/kg NBP明显增加了同侧SVZ中的Brd U和Brd U/Nestin-阳性细胞数(P0.01)。2 qRT-PCR分析显示:与Vehicle组相比,NBP组明显增加Wnt通路相关基因如Wnt-3a、β-Catenin、核转录因子(TCF-4)和Wnt靶基因(Cyclin D1)的表达,抑制GSK-3β的基因表达(*P0.05,**P0.01)。Western blot分析显示,与Vehicle组相比,NBP组明显增加Wnt-3a、TCF-4、Cyclin D1的蛋白表达及p-GSK-3β/GSK-3β的比例,降低p-β-Catenin/β-Catenin的比例(P0.05)。3 qRT-PCR和Western blot结果显示:在d MCAO小鼠脑组织,侧脑室注射DKK1引起Wnt下游信号分子β-Catenin明显减少(*P0.05,**P0.01)。在术后7天,DKK1抑制Wnt信号通路后可导致神经干细胞增殖减少(P0.05)。然而,与DKK1组相比,DKK1+NBP组显著增加了Brd U和Brd U/Nestin-阳性细胞数(P0.01)。4 qRT-PCR分析显示:脑室内注射DKK1引起GSK-3β表达增强,β-Catenin、TCF-4和Cyclin D1表达降低,而DKK1+NBP治疗逆转了这一结果(▲P0.05,▲▲P0.01)。Western blot分析显示:DKK1处理显著降低p-GSK-3β/GSK-3β的比例,减少转录因子和下游靶基因如TCF-4和Cyclin D1表达水平,并增加p-β-Catenin/β-Catenin的比例,然而DKK1+NBP治疗后逆转了这一结果(▲P0.05,▲▲P0.01)。这些结果表明NBP通过激活Wnt/β-Catenin通路,促进神经干细胞增殖。第三部分丁苯酞对实验性脑梗死小鼠神经干细胞迁移和分化的影响及其相关机制研究目的:通过测定神经干细胞迁移和成熟的标记物及神经营养因子相关因子表达水平,观察dl-NBP对实验性脑梗死小鼠神经干细胞迁移、分化以及对神经营养因子的影响。方法:采用健康成年雄性C57BL/6小鼠为研究对象,通过电凝法建立d MCAO模型。将C57BL/6小鼠随机分为以下各组:假手术组(Sham)、Sham+NBP组(Sham+NBP)、Vehicle组(Vehicle)和NBP组(NBP)。于术后14天使用DCX+和Brd U+/DCX+标记评估NBP对神经干细胞迁移的影响,通过qRT-PCR、Western Blot和免疫荧光染色测量NBP对VEGF、BDNF、SDF-1等神经营养因子表达的影响。于术后28天使用Brd U+/Neu N+、Brd U+/GFAP+来评估NBP对神经干细胞分化的影响。结果:1 Sham组中DCX+主要位于SVZ区,而脑缺血后,大量的DCX+细胞分布在同侧SVZ和缺血性皮层之间的白质中。20 mg/kg NBP促进更多的DCX+细胞从SVZ沿着胼胝体向缺血皮层的路径迁移(P0.01)。沿着胼胝体三个区域的每个区域单独分析时,NBP组DCX+细胞密度均高于Vehicle组(P0.05)。同时,与Sham组相比,Vehicle组明显增加了Brd U+/DCX+细胞数量。与Vehicle组相比,NBP组中Brd U+/DCX+细胞数量显著增加(P0.01)。并且,DCX-阳性细胞迁移过程中位于胼胝体CD31标记的血管附近。2 qRT-PCR分析显示,在术后14天,NBP处理的小鼠中VEGF和BDNF的基因表达显著高于Vehicle组小鼠(P0.05)。在Vehicle和NBP组之间,SDF-1基因水平没有显著差异。Western blot结果进一步证实:在术后第14天,Sham组VEGF和BDNF的蛋白表达较低,但NBP组蛋白表达明显高于Vehicle组(P0.05)。Vehicle和NBP组之间SDF-1表达没有显著差异。免疫荧光染色显示:在缺血半暗带区域,NBP组VEGF和BDNF阳性皮层神经元明显多于Vehicle组(P0.05)。免疫荧光双标记显示:VEGF和BDNF分别共定位于缺血皮质中的CD31阳性细胞,表明这些神经营养因子部分来源于皮层脑微血管。3在术后第28天,Sham组小鼠皮层没有检测到Brd U/Neu N-阳性细胞。与Vehicle组相比,NBP组小鼠皮层中Brd U/Neu N-阳性细胞的数量明显增加(P0.001)。然而,在Vehicle组和NBP组之间,Brd U/GFAP-阳性细胞数量未发现明显差异(P0.05)。与Sham组相比,Vehicle组缺血半暗带皮层中GFAP+细胞密度显著增加(P0.001)。然而,Vehicle组和NBP组之间没有明显差异(P0.05)。结论:1本实验在成年雄性C57BL/6小鼠成功建立电凝法d MCAO模型,发现术后1天腹腔注射NBP 20 mg/kg可以显著降低小鼠的神经功能缺损症状,且在术后7天明显减小脑梗死体积,提示20 mg/kg NBP有脑保护作用,在慢性期可显著促进脑缺血小鼠的神经功能恢复。2 NBP干预可以使小鼠缺血半暗带区的微血管密度显著增多,改善脑血流灌注量,提示NBP有促进血管新生的作用。3 NBP干预可以通过激活Wnt/β-Catenin信号通路促进缺血性卒中后SVZ区神经干细胞增殖,通过上调神经营养因子的表达募集更多的内源性成神经细胞迁移到受损区域,并分化为成熟的神经元,从而改善慢性期脑缺血小鼠的神经功能恢复。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R743.3
【参考文献】
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本文编号:1805518
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