帕金森病细胞模型中一氧化氮应力影响细胞凋亡的机制研究

发布时间：2018-04-26 10:35

本文选题：帕金森病 + SH-SY5Y　；参考：《中国科学院北京基因组研究所》2014年博士论文

【摘要】：一氧化氮(nitric oxide, NO)是生物体内一种活泼的氮氧自由基分子。内源性NO应力可诱导蛋白质的半胱氨酸残基发生亚硝基化修饰,这种修饰影响蛋白质的空间结构和生物活性,由此参与调节血管平滑肌伸缩、神经信号传导、免疫调节等多种生物过程。帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一类严重危害中老年人群的神经退行性疾病。在PD病患的脑组织中广泛存在NO应力升高和蛋白质氧化修饰增强的现象。一般认为,NO应力与PD中多巴胺神经元的凋亡过程相关,但是分子机制尚未完全阐明。本研究选择了一种广泛接受的PD多巴胺神经元凋亡研究模型,即鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞凋亡；考察了该模型在正常和PD两种状态下,NO应力的改变和蛋白质亚硝基化修饰状态的改变；探索了亚硝基化可能影响SH-SY5Y细胞凋亡通路变化的分子机制。采用多方位的细胞行为和生物化学性质检测,我们发现SH-SY5Y细胞内的NO水平与鱼藤酮浓度和处理时间呈正相关,而且鱼藤酮处理后的细胞出现典型的细胞凋亡表型。我们建立了一种生物素置换标记与差异凝胶电泳相结合的蛋白质组学方法(CyDye switch/2D-DIGE),力图全面跟踪SH-SY5Y细胞内蛋白质亚硝基化的状态改变。CyDye switch/2D-DIGE方法能够避免传统技术中巯基亚硝基化标记不稳定的缺点,也具备较高的通量筛选亚硝基化的差异蛋白质。比较鱼藤酮处理后SH-SY5Y细胞的CyDye switch/2D-DIGE图谱,我们发现了213个荧光斑点,其中7个斑点的光密度强度在鱼藤酮处理后增强1.5倍以上。将差异斑点的胰蛋白酶消化产物送至生物质谱检测,结果表明,这些蛋白质的功能迥异,但大多被报道与巯基亚硝基修饰相关。在所有上调的亚硝基化修饰蛋白质中,增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)是一个广为报道的与细胞增殖和凋亡相关蛋白质分子。一般认为,细胞核内PCNA通过影响DNA复制和修复来调控细胞凋亡；然而在SH-SY5Y中,我们观察到PCNA主要定位于细胞质中,而不是在细胞核内。这促使我们追问,细胞质PCNA的亚硝基化是否与该模型的凋亡相关?通过SH-SY5Y细胞质PCNA互作蛋白质组的分析,PCNA被证实与半胱天冬蛋白酶-9 (caspase9)有较为强烈的相互作用,而后者恰好是细胞质中凋亡信号通路的启动分子之一。利用高精度质谱分析发现,PCNA存在两个亚硝基化位点,Cys81和Cys162。利用蛋白质的定点突变和pull-down实验则进一步揭示,Cys81的亚硝基化显著降低了PCNA口caspase9之间的相互作用。在caspas e9的剪切激活实验中,PCNA的相互作用可抑制caspase9的自剪切过程,但是亚硝基化的PCNA失去了这种抑制作用。生物信息学分析还表明,PCNA的Cys81亚硝基化可能导致蛋白质构象改变,而PCNA的Cys162亚硝基化并不影响空间构型。因此,我们推论,PCNA/caspase9的相互作用可能发生在PCNA的Cys81附近的区域,这样该位点的修饰才能对相互作用发挥显著影响。在本研究中,我们提出了NO应力影响PD多巴胺神经元凋亡的一种新型分子调节机制。在PD细胞凋亡研究模型中,鱼藤酮诱导引发SH-SY5Y细胞中NO应力增高,NO则进一步广泛地引起修饰蛋白质亚硝基化修饰。SH-SY5Y胞质中的PCNA是一个NO攻击的重要蛋白质之一,其亚硝基修饰的位点主要集中在Cys81。该位点的亚硝基化修饰造成了PCNA构型变化,弱化了PCNA与caspase9间相互作用,从而促进了细胞凋亡通路的活化。
[Abstract]:Nitric oxide ( NO ) is an active nitrogen - oxygen free radical molecule in the organism . The endogenous NO stress can induce the alteration of cysteine residues in the protein . This modification affects the spatial structure and biological activity of the protein . Parkinson ' s disease ( PD ) is a kind of neurodegenerative disease which is seriously harmful to the middle - aged and old people . The Parkinson ' s disease ( PD ) is a kind of neurodegenerative disease which seriously endangers the middle - aged and old people .
The change of NO stress and the modification of the modification state of protein were investigated under both normal and PD conditions .
CyDye switch / 2D - DIGE method was used to detect the changes of intracellular protein in SH - SYY cells . CyDye switch / 2D - DIGE method was used to detect the changes of protein in SH - SYY cells .
In this study , the interaction between PCNA and caspase - 9 ( caspase9 ) could be inhibited by the interaction between PCNA and caspase - 9 ( caspase9 ) .

【学位授予单位】：中国科学院北京基因组研究所
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R742.5;R-332

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