具有中枢神经系统损伤修复潜能的PTEN基因miR RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

发布时间：2018-04-26 23:04

本文选题：损伤修复 + PTEN沉默　；参考：《吉林大学》2017年硕士论文

【摘要】：随着分子生物学和遗传学的发展,基因工具成为研究基因和蛋白之间相互关系、探索细胞内信号传导通路、解密受损细胞修复机制、开发神经保护类药物的有力手段。前期研究表明用化学合成的si RNA体外转染类神经元细胞沉默PTEN基因能够激活m TOR信号通路,促进类神经元突起的生长,以及氧化应激的类神经元生长锥的生长。但是用si RNA研究基因和蛋白之间的相互关系存在一定局限性,例如无法更换启动子、无法实现基因的长效抑制,为了更进一步的研究PTEN基因与中枢神经系统损伤之间的相互关系,我们将目光聚焦于micro RNA介导的基因沉默。选择含有增强型绿色荧光蛋白(e GFP)标记物的慢病毒载体p WPXL(12257)为载体骨架,选择靶向PTEN m RNA的micro RNA作为目的基因,构建重组慢病毒载体,实现对PTEN m RNA的特异性沉默;随后运用慢病毒包装技术将重组慢病毒载体包装成慢病毒颗粒,用慢病毒颗粒感染细胞进而发挥基因沉默效能,实现对靶细胞PTEN基因高效、稳定、长期干扰。通过在大鼠脊髓半横断损伤模型注射慢病毒颗粒观察和检测慢病毒颗粒能否在实验动物体内长期稳定表达,且发挥基因干扰效能。方法:通过引物设计(转录产物为靶向PTEN m RNA的micro RNA)、PCR、胶回收、T载体连接、酶切、转化、质粒提取、目的片段与载体骨架连接的方法进行三个重组慢病毒载体构建,命名为12257-PTEN-micro RNA1、12257-PTENmicro RNA2、和12257-PTEN-micro RNA3;重组慢病毒载体进行测序检测目的片段是否与载体骨架相连、序列是否正确;用重组慢病毒载体转染PC12细胞观察重组载体能否激活m TOR信号通路,比较三个重组慢病毒载体的基因沉默效能;将干扰效率最高的重组慢病毒载体包装成慢病毒颗粒,该实验分为三组:(1)空白对照组;(2)空载体感染组;(3)PTEN RNAi组。检测慢病毒颗粒滴度,RT-PCR方法验证慢病毒颗粒的基因沉默效能。通过脊髓注射的方法用慢病毒颗粒感染大鼠脊髓半横断损伤模型,该实验分为四组,每组6只:(1)假手术组;(2)单纯损伤组;(3)空载体病毒颗粒感染组;(4)PTEN RNAi组;造模成功后第十四天取出脑组织;制作石蜡切片、进行免疫组织化学染色、观察病毒颗粒在实验动物体内的基因沉默效能。结果:三个重组慢病毒载体测序结果与原有序列比对显示干扰序列与载体骨架连接成功,序列正确;重组慢病毒载体转染PC12细胞结果显示p S6K阳性表达,其中重组慢病毒载体12257-PTEN-micro RNA2(在后续试验中写作12257-PTEN-micro RNA)p S6K表达水平最高;将基因干扰效率最高的重组慢病毒载体12257-PTEN-micro RNA包装成慢病毒颗粒,滴度测定结果显示空载体感染组BT=4×108TU/ml,PTEN RNAi组BT=7×108TU/ml;重组慢病毒颗粒感染C6细胞72小时后RT-PCR结果表明,与空载体感染组相比,PTEN RNAi组PTEN m RNA表达水平明显降低(P0.05);慢病毒颗粒感染大鼠脊髓半横断损伤模型14天后,脑组织运动皮质区免疫组织化学染色结果显示:假手术组、单纯损伤组e GFP阴性表达,空载体病毒颗粒感染组、PTEN干扰组e GFP阳性表达;假手术组、单纯损伤组、空载体病毒颗粒感染组p S6K阴性表达,PTEN干扰组p S6K阳性表达。结论:成功构建能够沉默PTEN基因的重组慢病毒载体,重组慢病毒载体包装成的慢病毒颗粒能够稳定感染体内外细胞,病毒颗粒能够沿轴突逆行至神经元胞体,通过长期稳定的沉默PTEN基因,发挥基因干扰作用。
[Abstract]:In order to further study the relationship between PTEN gene and central nervous system injury , it was suggested that the expression of PTEN gene could be activated by slow virus particles . The results showed that the recombinant lentivirus vector 12257 - PTEN - micro RNA2 ( 12257 - PTEN - micro RNA in the follow - up trial ) had the highest expression level . Conclusion : A recombinant lentivirus vector capable of silencing PTEN gene is successfully constructed . The recombinant lentivirus particles can stably infect the external cells in vivo , and the virus particles can retrograde to the neuronal cell body along the axon , and play a role in gene interference through the long - term stable silencing of PTEN gene .

【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R741

【参考文献】