实时震动诱导蛋白扩增方法建立及初步应用

发布时间：2018-05-09 06:59

本文选题：朊病毒病 + 朊病毒　；参考：《中国疾病预防控制中心》2017年博士论文

【摘要】：阮病毒病(prion diseases),是一类侵袭人类及多种动物中枢神经系统的退行性脑病,潜伏期长,100%致死率。人类的朊病毒病包括克雅氏病(CJD)、致死性家族性失眠症(FFI)、库鲁病(Kuru)、吉斯特曼-施特劳斯综合征(GSS)等。其中克雅氏病分为散发型克雅氏病(sCJD)、遗传型克雅氏病(gCJD)、医源型克雅氏病(iCJD)、以及变异型克雅氏病(vCJD)。朊病毒病的感染因子是朊病毒,这是一种不含有核酸、具有自我复制能力的感染性蛋白。朊病毒是由体内正常表达的具有GP1锚的朊蛋白(PrpC)发生错误折叠,变为致病形式朊病毒(PrPSc)。PrPC与PrPSc的氨基酸序列完全相同,只是二级结构不同。目前朊病毒病确诊诊断需要在脑组织中发现PrPSc,但脑组织不容易获得。我国绝大部分患者是根据临床表现、临床检测以及实验室检测结果做出临床克雅氏病诊断。因此需要一种使用其他组织或体液的方法来检测PrPSc,做出准确诊断。实时震动诱导蛋白扩增(RT-QuIC)方法利用PrPSc能够诱导PrPC转化的特点,在体外通过不断的震荡-孵育循环,使PrPSc大量扩增,并通过硫黄素T(ThT)实时反映PrPSc的量。RT-QuIC方法具有高通量,高速度,灵敏度高,特异型高等特点。有报道RT-QuIC能够检测脑脊液中的PrPSc。相比脑组织检测,更容易被患者接受。因此RT-QuIC方法对克雅氏病的诊断具有十分重要的意义。目前我国还没有关于RT-QuIC的报道。在本研究中,我们首次建立了基于重组仓鼠PrP23-231片段的RT-QuIC方法,该方法能够从1μl 10-8稀释度的仓鼠263K脑匀浆中检测出PrPSc。同时我们对几种可能影响RT-QuIC方法的因素进行探索。我们发现 lxPBS,170mM 氯化钠(NaCl),1OOmM EDTA,10μM ThT,lng SDS,10μg重组蛋白以及10μl的脑脊液体积是更加理想的RT-QuIC条件。应用RT-QuIC方法,我们探索不同朊病毒毒株的反应特点。在毒株准备上,除了实验室已经拥有263K仓鼠毒株,139A、ME7小鼠毒株,以及SMB-S15细胞。我们还试图制备SMB-S15细胞染毒小鼠毒株。我们使用S15细胞去染毒不同品系(CD1、Balb/C、C57)小鼠,经过大约170天左右,所有染毒小鼠均表现出了朊病毒病。通过对脑组织切片检测,也发现了典型的神经病理学改变。用三种小鼠脑组织继续染毒下一代,其潜伏期缩短为150天左右。结果表明本研究成功获得了三种S15细胞染毒的小鼠毒株。不同毒株的RT-QuIC反应性不同。首先对于我们的RT-QuIC反应,由于使用了仓鼠重组PrP23-231片段,因此263K仓鼠来源毒株的反应效率是最好的,优于小鼠来源和细胞来源;其次,同样是S15细胞来源的脑组织和细胞匀浆比较,动物脑组织的反应效率要优于细胞匀浆。我们使用RT-QuIC方法还对不同朊病毒病患者脑脊液的反应特点进行了探索。首先是散发型克雅氏病。我们对70例克雅氏病临床诊断患者,以及48例不支持克雅氏病诊断患者的脑脊液样本进行了检测。克雅氏病临床诊断患者显示出了更高的阳性率(57.14%),同时在更早的时间内出现荧光值升高(50小时内),更高的最大荧光强度(大于25000 rfu)。与之对比,不支持克雅氏病诊断患者中只有少数样本结果阳性,并且荧光值升高的时间在50小时之后,最大荧光强度在25000 rfu以内。在我国最常见的三种遗传型克雅氏病分别是FFI、T188K突变、以及E200K突变。这三种遗传型克雅氏病的临床表现、临床检查结果、实验室检查结果、以及神经病理学都有明显的不同。在本研究中,我们还探索了这三种遗传型克雅氏病患者脑脊液在RT-QuIC上的反应特性。我们总共检测了 24例FFI、25例T188K以及16例E200K患者的样本。其中16.7%的FFI、52%的T188K、以及62.5%的E200K表现出RT-QuIC反应阳性结果。通过计算阳性结果的荧光值上升时间和最大荧光强度,我们发现E200K拥有最早的荧光值上升时间,以及最大的荧光强度,其次为T188K,而FFI样本则表现出非常低的RT-QuIC反应性。另外统计学分析显示RT-QuIC的阳性结果与14-3-3蛋白、脑部核磁以及脑电图有明显的相关性。通过本研究,建立了我国第一个RT-QuIC方法。该方法可以应用于不同朊病毒毒株的PrPSc检测,同时也能够对不同朊病毒病患者脑脊液中的PrPSc进行检测。对未来我国克雅氏病的监测诊断有重大意义。
[Abstract]:In this study , PrPSc can be detected by RT - Quic method , which is characterized by high flux , high speed , high sensitivity and high specificity . The results showed that the reaction efficiency of three kinds of brain tissue was better than that of mouse source and cell . The results showed that the reaction efficiency of different strains was better than that of mouse source and cell . In this study , we found that E200K has the earliest fluorescence value rise time and the maximum fluorescence intensity , and the maximum fluorescence intensity , followed by T188K , and E200K mutation . In this study , we have found that E200K has the earliest fluorescence value rise time and the maximum fluorescence intensity .

【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R742.9

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