肝豆汤改良方调节高铜诱导神经元损伤的信号调控机制的研究

发布时间：2018-05-10 13:03

本文选题：肝豆汤改良方 + TX小鼠　；参考：《安徽中医药大学》2014年硕士论文

【摘要】：研究背景肝豆状核变性又称Wilson病(Wilson’s disease, WD)，是一种常染色体隐性遗传铜代谢障碍性疾病。临床上以肝损害、神经精神症状、锥体外系症状、角膜K-F环等为主要表现，严重者可危及生命。但Wilson病是少数可以治疗的神经遗传病之一。目前国内外主要以青霉胺为代表的金属螯合剂治疗WD，有驱铜量高、显著改善症状等优点，但对已存在严重神经症状的WD患者难以奏效。而本课题组所在单位通过近三十年研究发现肝豆汤治疗WD有一定的效果，且在此基础上的改良方治疗脑型WD患者获得了更好的效果。虽然我们发现肝豆汤改良方能减轻和恢复脑型WD患者的神经精神症状，但其产生疗效的确切机制尚不明确。本研究拟通过逆转录PCR（RT-PCR）、免疫组织化学技术和蛋白质免疫印迹（Western blot）等技术，观察肝豆汤对保护WD动物模型-TX小鼠神经元损伤的信号调控机制，在分子水平初步阐明肝豆汤改善脑型WD患者临床症状的疗效机理。研究目的 1.观察肝豆汤改良方治疗前后TX小鼠神经行为学评分、血清Cu和脑组织Cu含量，以及脑组织病理学的改变，并探讨其改变的可能机制。 2.观察TX小鼠脑组织ASM、CER、JNK、P38的基因和蛋白表达水平，探讨ASM、CER、JNK、P38在高铜诱导神经元损伤中作用，以及肝豆汤改良方调节上述蛋白可能参与的信号通路保护神经元的机制，为肝豆汤改良方治疗WD提供实验理论依据。研究方法 1.将180只TX小鼠随机分为TX模型组、肝豆汤治疗组、丁苯酞对照组，，同时选用60只DL小鼠做正常对照组，丁苯酞为阳性对照药物。DL对照组饲养环境及喂食食物与治疗组相同，每日分两次予生理盐水各0.2ml/10g/次灌胃，连续2～4月。TX模型组饲养环境及喂食食物与治疗组相同，每日分两次予生理盐水各0.2ml/10g/次灌胃，连续2～4月。丁苯酞对照组TX小鼠喂食普通动物用颗粒饲料，丁苯酞每0.1g溶于12.5ml食用麻油中，配成混悬液，予丁苯酞80mg/kg的剂量进行灌胃治疗，并根据小鼠重量按0.2ml/10g/次，每日分两次予丁苯酞灌胃给药，连续2～4月。肝豆汤治疗组TX小鼠喂食普通动物用颗粒饲料，根据肝豆汤组方制备中药肝豆汤，并根据小鼠重量按0.2ml/10g/次，每日分两次予中药肝豆汤灌胃给药，连续2～4月。 2.观察治疗前后各组小鼠神经行为学评分。 3.检测各组小鼠治疗前后血清Cu和脑组织Cu含量的变化，以及脑组织HE染色病理学的改变，观察肝豆汤改良方对TX小鼠神经元保护的作用。 4.应用用免疫组化-DAB染色法和Western-Blot法检测肝豆汤改良方治疗后的TX小鼠脑组织ASM、Cer、P38、和JNK蛋白的表达水平，RT-PC技术检测ASMmRNA、CermRNA、JNKmRNA、P38mRNA表达水平，并探讨肝豆汤改良方调节上述蛋白参与脑损伤保护的信号转导机制。实验结果 1肝豆汤改良方对TX小鼠神经元损伤相关的影响 1.1TX小鼠神经行为学评分较正常DL小鼠高，经肝豆汤改良方治疗后降低。 1.2TX模型组血清Cu含量较同月龄DL对照组均降低，1月龄（P＜0.05），3月龄和5月龄（P＜0.01）。经肝豆汤改良方治疗后，肝豆汤治疗组较TX模型组血清Cu含量升高，治疗3月（P0.05），治疗5月（P＜0.01）；与DL对照组3月龄和5月龄比较，血清Cu含量低（P＜0.05）；与丁苯酞对照组比较血清铜含量低（P0.05）。 1.3TX模型组脑组织Cu含量较同月龄DL对照组升高，1月龄（P0.05），3月龄（P＜0.01），5月龄（P＜0.01）。肝豆汤治疗后TX小鼠脑组织Cu含量较TX模型组降低，治疗3月（P＜0.05），治疗5月（P＜0.05）；与DL对照组脑组织Cu含量比较升高（P＜0.01）；较丁苯酞对照组降低（P0.05）。 1.4TX小鼠脑组织HE染色在高倍镜下观察：1月龄TX模型组脑组织可见少量神经细胞间质水肿，胞核浓染、固缩，3月龄和5月龄小鼠神经细胞界限不清，细胞间距加大，有大量的深染、核固缩神经元，散在少量的变性坏死神经元；经肝豆汤治疗后，肝豆汤治疗组神经元损伤较TX模型组改善。 2肝豆汤改良方对铜诱导神经元损伤的细胞内外神经酰胺级联信号转导通路的调控机制 2.1免疫组化法检测ASM、Cer、JNK、P38表达：1）各蛋白阳性表达为棕黄色，ASM、Cer、P38在TX模型组及各治疗组均可见阳性细胞表达，TX模型组阳性表达较其他各组均显著增强（P0.01）；相同月龄肝豆汤治疗组脑组织各蛋白阳性表达较丁苯酞对照组稍高，但无统计学差异。2）JNK在DL对照组、TX模型组及各治疗组均可见阳性细胞表达，但JNK在TX模型组阳性表达较其他各组无显著统计学意义。 2.2RT-PCR检测各组TX小鼠脑组织中ASMmRNA、CermRNA、JNKmRNA、P38mRNA表达：ASMmRNA、CermRNA、P38mRNA在TX模型组表达较其他组增多，3月龄和5月龄都有显著统计学意义（P0.05）；JNKmRNA TX模型组较其他组无明显差异。 2.3Western-Blot法检测ASM、Cer、P38、JNK蛋白的表达：各蛋白水平在TX模型组较DL对照组表达量显著增强（P0.01）；治疗3月时，肝豆汤治疗组、丁苯酞对照组与TX模型组比较，阳性蛋白相对表达量下降（P0.05），治疗5月时，阳性蛋白相对表达量明显下降（P0.01）；肝豆汤治疗组脑组织各阳性蛋白相对表达量较丁苯酞对照组稍高，但无统计学差异。结论 1.铜在TX小鼠脑组织的过度蓄积，可引起TX小鼠神经行为学异常和脑组织损伤的表现。 2.铜负荷可诱导TX小鼠脑组织中神经酰胺信号通路激活引起脑细胞损伤。 3.肝豆汤改良方可以降低TX小鼠神经行为学评分。 4．肝豆汤改良方可以降低脑组织Cu含量，是其改善脑组织损伤的主要原因。 5.肝豆汤改良方能够下调TX小鼠脑组织中ASM、Cer、P38、JNK等蛋白的磷酸化水平，是改善脑组织损伤的重要原因。 6.肝豆汤改良方改善脑组织损伤与丁苯酞有相似的疗效，但其作用机制不同，为临床治疗WD提供一定的理论依据。
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【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R742.4

【参考文献】